一種采用微板和枯草芽孢桿菌檢測抗生素殘留的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種在微板上采用微生物方法檢測抗生素殘留的方法。這種方法采用枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)為供試菌，在96孔微板上對動(dòng)物源食品中的抗生素殘留進(jìn)行檢測，以溴甲酚紫為指示劑，通過指示劑的變色確定是否有抗生素的殘留。這種方法可以用在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對動(dòng)物源食品中的抗生素殘留進(jìn)行粗篩。通過實(shí)驗(yàn)表明，這種方法比傳統(tǒng)的平板微生物方法檢測效率高，節(jié)約成分，并成靈敏度高。該方法的主要步驟是：采用牛肉膏、葡萄糖、酵母粉和溴甲酚紫指示劑加蒸餾水配制成檢測培養(yǎng)基并將pH調(diào)至7.5，加入含有以上菌種的菌懸液，加入待測樣品，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，觀察培養(yǎng)基顏色變化以判定樣品中是否含有抗生素。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種用于動(dòng)物源食品，特別是鮮奶中抗生素殘留檢測的方法。
技術(shù)介紹
20世紀(jì)50年代人們發(fā)現(xiàn)將青霉素發(fā)酵殘?jiān)尤腼暳现形桂B(yǎng)動(dòng)物能大幅度提高畜禽的生長速度以來，抗生素對于動(dòng)物的促生長作用和它帶來的經(jīng)濟(jì)效益得到了充分的證實(shí)，如今抗菌藥物已成為畜牧業(yè)的必需品。歐美等發(fā)達(dá)國家都在使用抗生素添加劑，許多發(fā)達(dá)國家80%的畜產(chǎn)品都是用含抗生素添加劑的飼料生產(chǎn)出來的。由于抗生素添加劑具有節(jié)約營養(yǎng)、保持健康、提高生產(chǎn)性能等作用，因此，抗生素添加劑在推動(dòng)近代畜牧，尤其是集約化畜牧業(yè)的發(fā)展起了十分重要的作用，對亞洲等發(fā)展中國家或地區(qū)更是如此。可以這樣說，如果沒有抗生素及合成抗菌藥物，大多數(shù)亞洲國家的畜牧業(yè)就不會(huì)獲得今天這么大的成就。但抗生素的使用同時(shí)也帶來了一系列的問題，人們越來越關(guān)注農(nóng)產(chǎn)品中抗生素對人體健康的不良影響，國際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中常因抗生素殘留問題引起國際貿(mào)易摩擦。隨著我國全面建設(shè)小康社會(huì)步伐的不斷推進(jìn)，人民的生活水平的不斷提高，人們對農(nóng)產(chǎn)品安全問題也越來越得到重視。農(nóng)產(chǎn)品中抗生素、激素殘留污染問題已受到社會(huì)的廣泛重視，農(nóng)產(chǎn)品安全已成為當(dāng)今影響廣泛而深遠(yuǎn)的社會(huì)問題。抗生素殘留對人體具有一定的，有時(shí)甚至是嚴(yán)重的毒副作用，如對鏈霉素過敏的機(jī)體，即使攝取了含極少量的鏈霉素的食物，都會(huì)導(dǎo)致過敏反應(yīng)的發(fā)生，如果經(jīng)常食用含低劑量鏈霉素的產(chǎn)品會(huì)使原來對鏈霉素不起過敏反應(yīng)的個(gè)體致敏。發(fā)生過敏的機(jī)體會(huì)出現(xiàn)肌肉震顫、站立不穩(wěn)、心跳加速、呼吸減弱等癥狀。嚴(yán)重者可引起休克、短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)血壓下降、皮疹、喉水腫、呼吸困難等嚴(yán)重癥狀，甚至危及生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年就有20萬人死于藥品不良反應(yīng)，其中有40%也就是說有8萬人死于抗生素的濫用。目前，我國畜產(chǎn)品總量已經(jīng)達(dá)到了相當(dāng)大的規(guī)模，全國肉類產(chǎn)量已占世界肉類總產(chǎn)量的1/4以上，但是我國肉類產(chǎn)品的出口量卻很少，僅占左右，成了典型的生產(chǎn)的“巨人”，出口的“矮子”。我國畜產(chǎn)品出口不暢的原因主要是我國畜產(chǎn)品存在藥物殘留嚴(yán)重，品質(zhì)不優(yōu)，達(dá)不到進(jìn)口國家的要求。這是我國畜產(chǎn)品在歐美市場屢屢愛阻的主要原因。細(xì)菌物在反復(fù)接觸某一抗生素后，植物體內(nèi)的敏感菌株可能會(huì)受到選擇性抑制， 而使耐藥菌株大量繁殖。人在經(jīng)常食用含抗生素殘留的農(nóng)產(chǎn)品后，植物體內(nèi)的耐藥菌株可通過農(nóng)產(chǎn)品傳播給人體。日本、美國、德國、法國和比利時(shí)學(xué)者研究證明，在乳、肉和動(dòng)物臟器中都存在耐藥菌株，當(dāng)這些食品被人食用后，耐藥菌株就可能進(jìn)入到人的消化道內(nèi)，當(dāng)人體發(fā)生疾病時(shí)，再用同種抗生素治療很難奏效，給臨床上的治療帶來一定的困難。近年來隨著動(dòng)物疫病、農(nóng)作物病害的不斷增加和抗性不斷增強(qiáng)，抗生素的使用亦日趨泛濫，使其在動(dòng)物性食品、農(nóng)產(chǎn)品中過量殘留已成為危害人類身體健康的公共衛(wèi)生問題，并嚴(yán)重影響到貿(mào)易出口，從而受到國內(nèi)外的普遍關(guān)注。因此，如何對動(dòng)物性食品、農(nóng)產(chǎn)品中殘留的抗生素進(jìn)行特異、靈敏、快速的檢測已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。澳大利亞、加拿大、丹麥、德國、波蘭、瑞士、英國、美國、菲律賓、日本等國家和我國港、臺(tái)地區(qū)均開展了抗生素藥物殘留檢測研究工作，并制定了相應(yīng)的檢測方法及殘留限量。我國政府也高度重視這方面的工作，并相繼立項(xiàng)對殘留在食品中的多中抗生素進(jìn)行分檢測研究。抗生素檢測總體上可以分為三大類理化分析法(波譜法、色譜及聯(lián)用技術(shù))、免疫法(放射免疫法、熒光免疫法、酶聯(lián)免疫法)以及生物測定法(微生物測定法、放射受體測定法)。理化分析法是利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)或性質(zhì)來測定其含量， 該方法對抗生素進(jìn)行定性、定量測量，靈敏度高，但是一般需要昂貴的儀器設(shè)備、大量復(fù)雜的前處理、熟練的技術(shù)人員及較長的分析周期，而且只能用于單個(gè)樣本的檢測，因而不常用。免疫分析法是近年來發(fā)展起來的檢測動(dòng)物源食品中抗生素殘留的方法，這種方法具有操作簡單、前處理簡化、分析成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測快速、不需要昂貴的儀器等優(yōu)點(diǎn)。而且還可以同時(shí)測定幾個(gè)樣品，但此方法不可避免地也存在著一些缺陷，對試劑的選擇性高。很難同時(shí)分析多種成分，對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)，分析分子量很小的化合物或很不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。微生物檢測法根據(jù)抗生素對微生物的抑制作用來定性或者定量確定樣品中抗生素的殘留。這類方法可靠性高、操作簡單、費(fèi)用低，反應(yīng)靈敏，只需要幾個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)就能觀察到結(jié)果，還有特異性的特點(diǎn)，如蠟狀芽孢桿菌對四環(huán)素類敏感，枯草芽孢桿菌對氨基糖苷類敏感。此外，一些微生物有特定的用處，如嗜熱脂肪芽孢桿菌對多種抗生素敏感、生長速度快、培養(yǎng)溫度高，對其他菌污染少等特點(diǎn)。微生物法為目前抗生素檢測最常用的方法，目前該方法比較成熟的有牛津杯，但是牛津杯法工作量較大，反應(yīng)時(shí)間較長，要左右，一個(gè)培養(yǎng)皿只能檢測一個(gè)樣品等缺點(diǎn)，目前比較新穎的微生物檢測方法為微板法，該方法方便快捷，工作量小，反應(yīng)快速，只需要培養(yǎng)池左右就有顏色變化，此外一個(gè)板可以檢測多個(gè)樣品，對多個(gè)樣品檢測時(shí)優(yōu)勢較大。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是建立一種簡單、快速、靈敏度高、能夠普遍推廣應(yīng)用的抗生素殘留微生物檢測方法。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是⑴菌種活化準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基備用，在無菌條件下，挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌用劃線法接種至牛肉膏蛋白胨斜面，放入的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。本次試驗(yàn)復(fù)蘇后的菌種在 1-2天后使用。(2)搖菌及轉(zhuǎn)接根據(jù)測試搖床中枯草芽孢桿菌懸液的OD值來確定最佳搖菌時(shí)間，以便在最佳時(shí)刻進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)及檢測。當(dāng)OD值為0. 2時(shí)，菌的生長最旺盛，適合轉(zhuǎn)接培養(yǎng)檢測。在無菌操作臺(tái)上將枯草芽孢桿菌接到盛有75mL普通液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，封口，即刻放入搖床，在，150r/min的條件下?lián)u勻，適時(shí)測試其OD值，當(dāng)OD值為0. 2左右時(shí)(該實(shí)驗(yàn)大致為8小時(shí))，將菌懸液從搖床中取出，等待轉(zhuǎn)接。(3)制備混合菌液搖菌時(shí)間滿后，取出菌液瓶，在無菌操作臺(tái)上，用移液槍取擴(kuò)增好(待轉(zhuǎn)接)的菌液5mL(取前要充分搖勻)加入至IOOOmL培養(yǎng)基中混勻，該培養(yǎng)基含有葡萄糖1%，酵母粉 0. 2 %，牛肉膏0. 5 %，溴甲酚紫指示劑0. 00005 %。(4)微板的制作用移液槍取以上混合菌液270μ L，加入微板孔中，同時(shí)以未加菌液的培養(yǎng)基做無菌空白對照，在檢測樣品微板孔內(nèi)再加入加30 μ L牛奶樣品或其它動(dòng)物源食品的提取液。(5)檢測將所制得的檢測微板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后觀察結(jié)果。微板孔內(nèi)培養(yǎng)基顏色變黃說明樣品中不含有抗生素或是抗生素的含量低于方法的檢出限。微板孔內(nèi)培養(yǎng)基的顏色如果仍為紫色，說明樣品中有抗生素殘留。方法的檢測限(ppb)新霉素500鏈霉素3000慶大霉素300二雙氫鏈霉素3000卡那霉素5000氯霉素5000青霉素G5阿莫西林5應(yīng)用實(shí)例一在超凈工作臺(tái)中挑取前一天培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌單菌落，放入液體培養(yǎng)基中，放入搖床，55°C下震蕩培養(yǎng)7h，測0D600的范圍為0. 2-0. 4間。在微板第1列只加入270 μ L培養(yǎng)基，在2 12例之間加入的是270 μ L檢測培養(yǎng)基和菌懸液的混合溶液(其中檢測培養(yǎng)基87. 5 %，菌懸液12. 5 % )，然后在第1，3 6列上繼續(xù)加入30 μ L牛奶樣品，在第2列上加入無菌水，在7 12加入牛奶和抗生素的混合物， 其中A D加入的是青霉素和牛奶的混合物，7本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉興泉，
申請(專利權(quán))人：浙江農(nóng)林大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：