一種微生物總基因組DNA的提取方法技術

本發明專利技術公開了一種微生物總基因組DNA的提取方法，向待提取樣品中加入裂解液和溶菌酶，使細菌細胞充分破裂并釋放DNA；將獲得的粗提DNA經過酚/氯仿/異戊醇提取液抽提后得到經純化的微生物總基因組DNA。本發明專利技術提取方法具有DNA釋放量大、實驗條件簡易、成本低等有益效果。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于環境科學和生物技術科學領域，具體地涉及一種微生物總基因組DNA 的簡易提取方法，該方法借助于生物技術手段，獲取樣品中微生物基因組。
技術介紹
環境樣品由于其成分的復雜性在對其進行DNA提取時，想要得到量大，純度又高的DNA是比較困難的。相對于環境水樣中微生物DNA的提取，養殖池塘底泥中微生物DNA提取難度更大。一方面，養殖池塘底泥中微生物種類更為豐富，這就提高了在DNA提取過程中對裂解細胞壁的要求；另一方面，底泥中富含的懸浮物，腐殖質和硫化物等物質，都會影響到所提取到的DNA的純度，進而影響后續的PCR等實驗操作。所以，使環境樣品中微生物細胞壁充分裂解釋放DNA以及獲得純度較高的DNA樣品是養殖池塘底泥微生物總基因組DNA 提取和對底泥微生物多樣性分析的關鍵。本專利技術解決了養殖池塘底泥微生物總基因組DNA提取中存在的操作時間長，所提取的DNA量少而純度低等問題，提出了一種微生物總基因組DNA的提取方法，具有DNA釋放量大、實驗條件簡易、成本低等有益效果。
技術實現思路
本專利技術提出了一種微生物總基因組DNA的提取方法，包括以下步驟(1)將TENP洗液加入待提取樣品中，再經過8000rpm，4°C，離心得到沉淀；(2)向所述沉淀加入裂解液和溶菌酶溶液，于37°C進行水浴后，充分渦旋震蕩；(3)加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，依次于55°C、70°C下進行水浴，于17000g，4°C，離心得上清；(4)用等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提液對所述步驟(3)得到的上清進行抽提，經離心得上清，重復用等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提液抽提一次；(5)用等體積的氯仿/異戊醇抽提液抽提，離心得上清；(6)向所述步驟(5)得到的上清中加入異丙醇，室溫下靜置，離心得到DNA沉淀；(7)用乙醇將所述DNA沉淀重懸，離心后棄上清，經干燥得到沉淀；(8)用成分為IOmMTris-HCl, ImM EDTA, PH=8. 0的TE溶液將所述步驟(7)得到的沉淀溶解，得到所述微生物總基因組DNA，置于-20°C保存備用。當所述待提取樣品是含有水分的，所述步驟(2)中進行水浴前還加入玻璃珠，并對待提取樣品進行充分渦旋震蕩處理。所述的步驟(1)中TENP洗液pH為8 10，添加量為1. 5^3mL,優選添加量為2mL。所述 TENP 洗液成分為 50 m mol/L Tris, 20 m mol/L EDTA，100 m mol/L NaCl, 0. 59Γ2. 5%w/v聚乙烯基吡咯烷酮。其中，聚乙烯基吡咯烷酮的優選添加量為l%w/v。所述的步驟(2)中，所述裂解液成分為IM Tris-HCl,0. 5M EDTA，0. 5M Na3P04,1. 5M NaCl, 1% CTAB ；所述溶菌酶溶液添加量為200 400 μ L，濃度為10_80mg/mL。3所述的步驟(3)中，SDS溶液濃度為20% 25%W/v，添加量為100 200 μ L ；蛋白酶K 濃度為15-30mg/mL，添加量為50 100μ L。所述的步驟(4)中酚/氯仿/異戊醇抽提液中酚、氯仿、異戊醇的體積比例為 25:24:1ο所述的步驟(5)中氯仿/異戊醇抽提液中氯仿、異戊醇的體積比例為對:1。所述的步驟(6)中所述異丙醇的加入體積是步驟(5)得到的上清體積的0. 6倍。所述的步驟(7)中所述乙醇為預冷的70%乙醇，添加量為廣1. 5mL。本專利技術目的之一在于解決養殖池塘底泥微生物總基因組DNA提取過程中操作時間長，試劑價格昂貴以及提取到的DNA量少、純度不夠等問題。該方法可以很好的破裂革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的細胞壁，大量除去樣品中的腐殖質和蛋白質，所得的DNA可以用于PCR-DGGE技術，能較準確地反映出底泥環境中細菌微生物的豐度和種群多樣性。本專利技術將采集到的樣品先用洗液洗滌，然后經過玻璃珠，裂解液和溶菌酶的作用， 使細菌細胞充分破裂，釋放DNA。將獲得的粗提DNA經過酚/氯仿/異戊醇抽提后得到純化。按照本專利技術得到的DNA樣品純度較高，可直接用于后續的PCR等實驗操作，且本專利技術操作簡單，耗時短，一次可處理多個樣品，非常適合在實驗室條件下進行簡單的DNA提取。針對養殖池塘底泥類樣品中微生物總基因組DNA的提取，本專利技術具體操作步驟如下(1)把待提取樣品放入離心管中，用洗液除去樣品中的腐殖酸，SOOOrpm,4°C，離心后得到樣品沉淀；(2)所得的沉淀中加入玻璃珠，裂解液和溶菌酶溶液，37°C水浴Ih后，充分渦旋，使細菌充分裂解釋放DNA ；(3)離心管中加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，使蛋白變性或降解，55°C水浴20min，7(TC 水浴 IOmin, 17000g, 4°C，離心 IOmin 得上清；(4)所得的上清轉移至干凈離心管中，用等體積酚/氯仿/異戊醇抽提液抽提兩次，離心得上清；(5)上清轉移至干凈離心管中，用等體積氯仿/異戊醇抽提液抽提一次，離心得上清；(6)所得的上清中加異丙醇沉淀DNA，室溫下靜置一段時間，離心取沉淀；(7)所得的DNA沉淀用乙醇重懸，離心后棄上清，干燥沉淀；(8)所得的沉淀用TE溶液溶解，得到微生物總基因組DNA，并置于-20°C保存備用。上述步驟中洗液TENP的pH為10左右，可以有效地除去腐殖質。上述步驟⑵中溶菌酶的濃度為50mg/mL，添加量為300 μ L，渦旋時間為5 10min。上述步驟(3)中SDS濃度為25%w/v，添加量為100 μ L ；蛋白酶K的濃度為20mg/ mL，添加量為60 μ L。上述TE 溶液的成分為 10mmol/L Tris-Hcl，lmmol/L EDTA，溶液 pH=8。本專利技術上述方法也可適用于其他土壤中微生物DNA的提取，若待測樣品是干燥的土壤，可以省去適用于含有水分的底泥類樣品的玻璃珠，改為先用液氮研磨處理樣品后，再按本專利技術其他步驟進行操作。本專利技術方法是利用物理、化學和酶等多種方法對細胞壁進行裂解，從而最大限度地釋放DNA;另外，實驗中所用的所有試劑和儀器都是基礎的生物學實驗用品，容易獲得且價格低廉。使用本專利技術得到的DNA樣品，可直接用于16 S rDNA片段的擴增，得到的DGGE 圖譜能較準確地反映環境樣品中細菌的豐度和多樣性。附圖說明圖1養殖池塘底泥微生物基因組DNA電泳圖譜。圖2養殖池塘底泥微生物基因組DNA 16S rDNA擴增電泳圖譜。圖3養殖池塘底泥微生物基因組DNA PCR-DGGE電泳圖譜。具體實施例方式結合以下具體實施例和附圖，對本專利技術作進一步的詳細說明，本專利技術的保護內容不局限于以下實施例。在不背離專利技術構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本專利技術中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施例上海市金山區漕涇養殖基地對蝦養殖池塘底泥微生物DNA提取 1.底泥樣品的前期處理1. 1取底泥樣品0. 2g加入已滅菌的2mL TENP洗液(50 m mol/L Tris, 20 m mol/ L EDTA, 100 m mol/L NaCl，l%w/v 聚乙烯基吡咯烷酮，pH=10)，渦旋混勻，65°C水浴!3min， SOOOrpm離心5min，取沉淀。重復1步驟2 3次，直至上清變得較透明。2.底泥樣品中微生物細胞壁裂解2.1向1. 1步本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王亭芳，常忠義，高紅亮，趙云龍，金風杰，
申請(專利權)人：華東師范大學，
類型：發明
國別省市：