飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法技術

本發明專利技術涉及植物分子生物學領域，即一種飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法。特點是：將四倍體刺槐葉片裝入離心管磨細，加入冰浴緩沖液和β-巰基乙醇，離心棄上清，加入CTAB提取液和β-巰基乙醇，離心取上清液，加酚和氯仿，混勻離心取上清液，加入乙醇和醋酸鉀溶液混勻，冰浴靜置棄上清液，乙醇清洗后棄上清液，氣干，用ddH2O溶解RNA沉淀。其有益效果是：葉片直接在離心管里研磨以及利用氯仿只抽提一次，減少了操作時間和材料用量，提取液加入皂土可更好的去除蛋白的干擾，大量的醋酸鉀以去除多糖，從而獲得高純度、高產量且完整穩定的RNA，具有操作簡便、成本低、普通設備和國產化學試劑即可滿足要求等特點，為深入進行飼料型刺槐及同類植物的分子生物學研究提供了條件。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及植物分子生物學
，即一種飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法。
技術介紹
刺槐屬豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionaceae)植物，其葉片富含粗蛋白、糖、礦物質和維生素，是一種開發前景可觀的新型飼料，尤其是四倍體刺槐的葉片其蛋白和糖的含量更為豐富，深入研究飼料型四倍體刺槐的生物學特性，對于開發優質飼料資源，提升飼養業水平，具有重要的意義。可是，由于飼料型四倍體刺槐葉片中富含大量的蛋白質和多糖，使其總RNA的提取十分困難，限制了飼料型四倍體刺槐分子生物學層面的研究，使得四倍體刺槐的選育和開發利用受到局限。RNA(植物總核糖核酸)的提取技術是一項植物分子生物學的基本實驗技術之一， 也是進行植物分子生物學方面研究的必要前提。只有獲得純度高、完整性好的高質量總 RNA，才能用于mRNA純化、Northern雜交、構建cDNA文庫、通過RT-PCR分離基因以及進行蛋白質體外翻譯等分子生物學實驗操作。常用的植物組織總RNA提取方法有異硫氰酸胍法、SDS法、苯酚法、CTAB法、熱硼酸法、Trizol試劑盒法等。這些方法所用的核心試劑分別為異硫氰酸胍、SDS、CTAB和硼酸。 異硫氰酸胍能迅速破碎細胞，作為強變性劑使核酸一蛋白結構發生變化，并有效解離核蛋白與核酸的復合體，最終釋放出核酸。SDS(十二烷基硫酸鈉)是一種陰離子表面活性劑或離子去污劑，能從低離子強度溶液中沉淀核酸以及酸性多聚糖。CTAB(十六烷基三甲基氯化銨)作為陽離子表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使RNA游離出來。硼酸緩沖體系可將蛋白酶K消化蛋白和LiCl選擇性沉淀RNA等步驟偶聯在一起。植物組織中的蛋白質和多糖的大量存在，對RNA的純度和得率具有重要的影響， 四倍體刺槐尤其如此。實驗表明，采用常規設備和普通化學試劑，難以有效地去除或抑制刺槐葉片破碎細胞中的蛋白質等物質的干擾，無法提取高質量的RNA。采用高端設備和進口材料，雖然可以獲得RNA，但仍存在著過程復雜，成本高，產品不穩定，容易降解的問題。因此， 從富含粗蛋白和多糖的刺槐葉片中抽提高質量RNA，一直是業內公認的難題。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種能從富含粗蛋白和多糖的飼料型四倍體刺槐葉片中提取和純化總RNA，且過程簡單、操作方便、成本低廉、結果穩定的方法。上述目的是由以下技術方案實現的一種飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法，其特點是將四倍體刺槐葉片裝入離心管研磨成粉末，加入冰浴緩沖液和巰基乙醇，離心，棄去上清，向離心管中加入CTAB提取液和β-巰基乙醇混勻，離心，取上清液， 加水飽和酚和氯仿，混勻，離心，吸取上清液，加入無水乙醇和醋酸鉀溶液混勻，冰浴靜置后離心，棄去上清液，用70 %乙醇清洗后進行離心，棄掉上清液，氣干，用適量DEPC處理過的ddH20徹底溶解RNA沉淀。所說的飼料型刺槐葉片總RNA的提取方法，包括以下具體步驟(1)稱取0. 3g植物葉片直接放入1. 5mL的離心管中，并迅速放入液氮后，用更小的離心管將葉片研磨成粉末，加入700 μ 1冰浴緩沖液，60 μ 1 β-巰基乙醇，用旋渦混合器振蕩2-;3min混勻，在冰上放置IOmin后于4°C、12000g，離心lOmin。(2)棄去上清，向離心管中加入700 μ 1 CTAB提取液，50 μ 1 β-巰基乙醇，劇烈振蕩2-;3min混勻。(3)將離心管置于溫度為65°C的水浴7-9min，其間搖動幾次。(4)將離心管從水中取出后迅速置于冰上，加入體積比為1 1的水飽和酚與氯仿共700 μ 1，劇烈振蕩2-3min混勻后于4°C，12000g，離心IOmin0(5)取上清于另一新的離心管中，加入1/2體積的無水乙醇和1體積的5mol/L醋酸鉀(pH 5. 8)，緩慢搖動混勻，在冰上放置IOmin后于4°C，12000g,離心IOmin0(6)棄去上清，用75%乙醇清洗沉淀，緩慢混勻，4°C，12000g，離心5min。(7)棄去上清，瞬間離心徹底棄干，在通風櫥中氣干5min，用DEPC處理過的ddH20 徹底溶解RNA沉淀。所說的冰浴緩沖液是由100mmol/L 的 iTris-HCl (pH，8. 0)、25mmol/L 的 EDTA(pH， 8. 0)、2. Omol/L 的 NaCl 組成。所說的CTAB提取液中加入了皂土。所說的CTAB 提取液是由 2% 的 CTAB、0. 8% 的皂土、100mmol/L 的 Tris-HCl (pH， 8. 0)、25mmol/L 的 EDTA(pH, 8. 0),1. 4mol/L 的 NaClU % 的聚乙烯聚吡咯烷酮和 0. 1 % 的 DEPC組成。所說的75%乙醇是由7. 5份無水乙醇和2. 5份DEPC處理過的ddH20配制，DEPC處理過的ddH20是由0. 1份DEPC加入99. 9份ddH20中漩渦混勻再經高溫高壓滅菌的純水。本專利技術的有益效果是葉片直接在離心管里研磨，以減少操作時間和材料用量，利用加入皂土的提取液可更好的去除大量蛋白對RNA提取的干擾；利用氯仿/異戊醇只抽提一次，節省操作時間和費用；加入高濃度和大體積的醋酸鉀以去除多糖，從而獲得高純度、 高產量且完整穩定的RNA，可滿足反轉錄、基因克隆、轉錄組分析以及熒光定量PCR等分子生物學分析，且具有操作簡便、成功率高、適用范圍廣、無降解、普通設備和國產化學試劑即可滿足要求等特點，為深入進行飼料型刺槐以及同類植物的分子生物學研究提供了條件。附圖說明 圖1未加入皂土的CTAB法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA ；圖2利用Trizol提取的四倍體刺槐葉片的總RNA ；圖3SDS法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA ；圖4SDS-CTAB法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA ；圖5不同濃度皂土提取的四倍體刺槐葉片的總RNA。具體實施例方式本專利技術總的構思是以普通設備和國產化學試劑為主，以消除蛋白和多糖的干擾4為目標，采用了在提取液中加入皂土、沉淀前加入大量醋酸鉀等去除過多蛋白質及多糖的關鍵技術，進而得到完整穩定的RNA產品。具體做法是將刺槐葉片直接在離心管中研磨成粉末，加冰浴緩沖液和β-巰基乙醇，離心；棄去上清液，加提取緩沖液和β-巰基乙醇，振蕩混勻，熱水浴處理；加水飽和酚和氯仿，振蕩混勻，離心；吸取上清液加入無水乙醇和醋酸鉀溶液混勻、冰浴靜置后再離心，棄去上清液，用70%乙醇清洗后進行離心，棄掉上清液， 氣干，用適量DEPC處理過的ddH20徹底溶解RNA沉淀。圍繞上述技術路線的實施方式是很多的，為了說明問題，下面僅介紹一個實施例制備ddH20 由0. 1份DEPC加入99. 9份ddH20中漩渦混勻再經高溫高壓滅菌即得。制備75%的乙醇7. 5份無水乙醇和2. 5份DEPC處理過的ddH20配成。制備冰浴緩沖液100mmol/L的 Tris-HCl (pH，8. 0)，25mmol/L 的 EDTA(pH，8. 0)， 2.Omol/L 的 NaCl。制備CTAB 提取液2 % 的 CTAB，0. 8 % 的皂土，IOOmmol/L 的 Tris-HCl (ρΗ，8· 0)， 25mmol/L 的 EDTA(pH, 8. 0)，1. 4m本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法，其特征在于將四倍體刺槐葉片裝入離心管研磨成粉末，加入冰浴緩沖液和β-巰基乙醇，離心，棄去上清，向離心管中加入 CTAB提取液和β -巰基乙醇混勻，離心，取上清液，加水飽和酚和氯仿，混勻，離心，吸取上清液，加入無水乙醇和醋酸鉀溶液混勻，冰浴靜置后離心，棄去上清液，用70%乙醇清洗后進行離心，棄掉上清液，氣干，用適量DEPC處理過的ddH20徹底溶解RNA沉淀。2.根據權利要求1的飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法，其特征在于所說的提取方法包括以下具體步驟(1)稱取0.3g植物葉片直接放入1. 5mL的離心管中，并迅速放入液氮后，研磨成粉末， 加入700 μ 1冰浴緩沖液，60 μ 1 β -巰基乙醇，用旋渦混合器振蕩2-aiiin混勻，在冰上放置 IOmin 后于 4°C，12000g,離心 IOmin0(2)棄去上清，向離心管中加入700μ 1 CTAB提取液，50μ1 β-巰基乙醇，劇烈振蕩 2-3min 混勻。(3)將離心管置于溫度為65°C的水浴7-9min，其間搖動幾次。(4)將離心管從水中取出后迅速置于冰上，加入體積比為1 1的水飽和酚與氯仿共 700 μ 1，劇烈振蕩2-3min混勻后于4°C，12000g，離心IOmin0(5)取上清于另一新的離心管中，加入1/2體積的無水乙醇和1體積的5mol/L醋酸鉀 (pH 5. 8)，緩慢搖動混勻，在冰...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉磊，孟凡娟，黃鳳蘭，
申請(專利權)人：東北林業大學，
類型：發明
國別省市：