基于熒光淬滅的基因變異檢測方法及探針技術

本發明專利技術公開了一種基于熒光淬滅定量的基因變異檢測方法，主要步驟包括：1)提取樣本DNA；2)擴增待測基因片段；3)與帶熒光淬滅分子的探針及帶熒光分子的雙脫氧核苷三磷酸進行延伸反應；4)檢測熒光變化，計算熒光淬滅值；5)根據步驟4)的計算結果，判斷待測基因的SNP。本發明專利技術還公開了用于上述方法的寡核苷酸探針。該方法利用標記了淬滅分子的探針和標記了熒光分子的雙脫氧核苷三磷酸在待測基因的特異位點上進行單堿基延伸，然后通過檢測熒光淬滅值，確定探針末端延伸的堿基類型，如此提高了基因SNP檢測的特異性、靈敏度、便捷性和檢測效率，同時降低了檢測成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及核酸檢測
，特別是涉及一種基因SNP (單核苷酸多態性)的檢測方法及用于該方法的檢測探針。
技術介紹
基因科學是生物科學的一個重要領域，人的基因密碼序列及其變異會影響人體的多種生物功能和功能變異，通過檢測人的基因SNP (single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性)可以了解和預估人體的功能變異。當前，檢測基因SNP已成為分析判斷遺傳病、個體化藥物反應特征的重要手段，也是預測和預防許多疾病的重要手段，例如，糖尿病等內分泌疾病，以及各種腫瘤的易感因素。目前，基因SNP的檢測方法主要有測序法和Taqman探針法。測序法需要使用昂貴的測序儀，檢測成本較高，而且測序儀的操作使用和維護都比較復雜，因此大多數城市的醫院和科研單位都沒有配備測序儀。Taqman探針法的缺點是1、探針的篩選比較困難，一般一對探針需要經過多次篩選，才能選出較為合適的探針，而且經常遇到多次篩選不成功的情況；2、檢測一個基因的SNP需要兩個探針，因此成本較高；3、不是定點識別，因此對單堿基突變檢測的靈敏性和特異性不高，容易出現假陰性或假陽性。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種基于熒光淬滅的基因變異檢測方法，該方法簡便、高效、成本低，且特異性和靈敏度高。為解決上述技術問題，本專利技術的基于熒光淬滅的基因變異檢測方法，包括以下步驟1)提取樣本DNA ；2)以所述DNA為模板，擴增待測基因片段；3)將步驟2、的產物與帶熒光淬滅分子的探針及帶熒光分子的雙脫氧核苷三磷酸進行延伸反應；4)檢測步驟幻的延伸反應產生的熒光變化，計算熒光淬滅值；5)根據步驟4)的計算結果，判斷所述待測基因的SNP。步驟幻中，所述熒光淬滅分子與所述探針的序列末端的距離為3 35bp。步驟4)中，還包括熒光淬滅值的校正步驟。可以應用外標法(即以熒光自然衰減為對照)，對熒光淬滅值進行校正。本專利技術要解決的另一技術問題是提供一種用于上述方法的寡核苷酸探針。為解決上述技術問題，本專利技術的寡核苷酸探針，是一段標記有熒光淬滅分子的由 15 45個核苷酸組成的寡核苷酸序列；所述熒光淬滅分子與所述寡核苷酸序列末端的距離為3 3^dp。本專利技術的基因變異檢測方法利用標記了熒光淬滅分子的特異序列探針和熒光分子標記的雙脫氧核苷三磷酸在待測基因的特異位點上進行單堿基延伸，然后通過檢測在探針末端延伸的熒光分子標記的堿基的熒光淬滅值，來確定探針末端延伸的堿基類型，亦即待測基因特異位點的堿基類型。與測序法相比，本專利技術的檢測方法不僅大幅節省了檢測時間和成本，還能避免過度擴增帶來的假陽性；而與Taqman探針法相比，本專利技術對基因SNP檢測的特異性和靈敏性更高。此外，本專利技術既可以采用實時熒光定量PCR儀作為檢測平臺， 也可以采用普通PCR儀和熒光酶標儀作為檢測平臺，從而能夠在各醫院和科研機構普及應用。附圖說明圖1是本專利技術實施例1圖2是本專利技術實施例1圖3是本專利技術實施例1圖4是本專利技術實施例1圖5是本專利技術實施例1圖6是本專利技術實施例2圖7是本專利技術實施例2圖8是本專利技術實施例2圖9是本專利技術實施例2圖10是本專利技術實施例的實驗組1的實時熒光原始圖譜； 的實驗組2的實時熒光原始圖譜； 的實驗組3的實時熒光原始圖譜； 的外標對照組的實時熒光原始圖譜； 的空白對照組的實時熒光原始圖譜； 的實驗組1的實時熒光原始圖譜； 的實驗組2的實時熒光原始圖譜； 的實驗組3的實時熒光原始圖譜； 的外標對照組的實時熒光原始圖譜； i的空白對照組的實時熒光原始圖譜。具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本專利技術作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本專利技術，而不用于限制本專利技術的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例15HT2A基因的SNP檢測1.樣本DNA的提取取適量的人口腔上皮黏膜細胞(由JANPA DNA BASED TESTING Co. Ltd.提供)，提取其基因組DNA。2. PCR 擴增以所提取的DNA為模板，對該DNA中的5HT2A基因片段進行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)擴增。PCR反應的引物序列如下正向引物CAAGGTGAATGGTGAGCAGA(SEQ ID NO 1)反向引物AGAGACACGACGGTGAGAGG(SEQ ID NO 2)上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR 反應體系為10 XPCR 緩沖液 1.5 μ L，25mM Mg2+L 2 μ L，IOmM dNTP 0. 3 μ L, 甜菜堿(Betaine) 2 μ L，DNA模板1 μ L，5 μ M正向弓丨物1 μ L，5 μ M反向弓丨物1 μ L，5U/μ LrTaqO. 1 μ L, H2O 6. 9 μ L, 禾只 15 μ L0PCR反應條件如表1所示表IPCR反應條件權利要求1.一種基于熒光淬滅的基因變異檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)提取樣本DNA；2)以所述DNA為模板，擴增待測基因片段；3)將步驟幻的產物與帶熒光淬滅分子的探針及帶熒光分子的雙脫氧核苷三磷酸進行延伸反應；4)檢測步驟幻的延伸反應產生的熒光變化，計算熒光淬滅值；5)根據步驟4)的計算結果，判斷所述待測基因的SNP。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟幻中，所述熒光淬滅分子與所述探針的序列末端的距離為3 35bp。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟幻中，所述熒光淬滅分子為BHQl，所述熒光分子為熒光素和R6G。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，還包括應用外標法對所述熒光淬滅值進行校正。5.根據權利要求1或4所述的方法，其特征在于，步驟4)中，還包括計算淬滅比和淬滅判別系數，所述淬滅比為熒光淬滅值與初始熒光值的比值，所述淬滅判別系數為相應通道的淬滅比與所有通道的淬滅比之和的比值。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟5)中，根據淬滅判別系數判斷所述待測基因的SNP;所述淬滅判別系數在65%以上時，判定為純合子；所述淬滅判別系數大于 35%，小于65%時，判定為雜合子。7.一種寡核苷酸探針，其特征在于，該探針是一段標記有熒光淬滅分子的由15 45 個核苷酸組成的寡核苷酸序列；所述熒光淬滅分子與所述寡核苷酸序列末端的距離為3 35bp0全文摘要本專利技術公開了一種基于熒光淬滅定量的基因變異檢測方法，主要步驟包括1)提取樣本DNA；2)擴增待測基因片段；3)與帶熒光淬滅分子的探針及帶熒光分子的雙脫氧核苷三磷酸進行延伸反應；4)檢測熒光變化，計算熒光淬滅值；5)根據步驟4)的計算結果，判斷待測基因的SNP。本專利技術還公開了用于上述方法的寡核苷酸探針。該方法利用標記了淬滅分子的探針和標記了熒光分子的雙脫氧核苷三磷酸在待測基因的特異位點上進行單堿基延伸，然后通過檢測熒光淬滅值，確定探針末端延伸的堿基類型，如此提高了基因SNP檢測的特異性、靈敏度、便捷性和檢測效率，同時降低了檢測成本。文檔編號C12Q1/68G本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：石睿，黃博淳，
申請(專利權)人：上海千友生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：