本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)的方法及體外診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒采用用一對(duì)HLA-B27特異性引物和一條特異性熒光探針快速檢測(cè)HLA-B27。本試劑盒運(yùn)用1對(duì)HLA-B27特異性引物和1條特異性熒光探針能快速準(zhǔn)確檢測(cè)人外周血等樣本中的HLA-B27基因，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、省時(shí)、省力、成本低廉和高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床強(qiáng)直性脊柱炎、Reiter綜合癥、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎伴關(guān)節(jié)病、急性前葡萄膜炎等許多嚴(yán)重危害人類健康的脊柱性關(guān)節(jié)病的輔助診斷。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬臨床醫(yī)學(xué)生物檢測(cè)
，具體涉及一種快速人白細(xì)胞抗原 B27 (HLA-B27)的試劑盒及檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
在組織或器官移植中，供者與受者之間相容(不排斥)還是不相容(排斥)都是由它們組織特異性所決定的。這種代表個(gè)體特異性的組織抗原稱組織相容性抗原，一套這樣的抗原系統(tǒng)稱主要組織相容性系統(tǒng)(major histocompatibility system, MHS)。編碼MHS 的基因群稱為主要組織相容性復(fù)合體MHC即指某一染色體上一群緊密連鎖的基因群。人的MHC就稱人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，HLA作為抗原研究時(shí)，稱HLA抗原系統(tǒng)；HLA作為基因研究時(shí)稱HLA復(fù)合體，它位于第6號(hào)染色體短臂上 6p21. 3，全長(zhǎng)40001Λ。它是為200個(gè)以上基因座位組成的基因復(fù)合體；是迄今已知基因中等位基因多態(tài)性最高的基因復(fù)合體；其多態(tài)性與疾病的遺傳易感性有明顯關(guān)系。HLA有I類、 II類和III類基因，HLA-B是I類HLA的三個(gè)位點(diǎn)(HLA-A、HLA-B, HLA-C)之一。HLA-B27是位于人第6號(hào)染色體HLA基因B座位的一個(gè)等位基因。強(qiáng)直性脊柱炎 (ankylosing spondylitis, AS)患者HLA-B27陽(yáng)性率高達(dá)94%，而正常人群僅為9%。對(duì)疑似AS患者進(jìn)行HLA-B27檢測(cè)，已成為臨床重要的輔助診斷手段。目前HLA-B27檢測(cè)手段主要有血清學(xué)方法如微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(CDC)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、ELISA法、引物特異性聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)等。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，由于很難獲得高質(zhì)量單價(jià)抗血清，單份血清很容易漏檢或出現(xiàn)假陽(yáng)性，而采用多份血清又常常會(huì)遇到部分血清陽(yáng)性時(shí)難以判斷結(jié)果的現(xiàn)象。ELISA法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)，不利于大批量臨床標(biāo)本檢測(cè)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異性，但需要配置流式細(xì)胞儀，硬件需求高，且檢測(cè)結(jié)果受標(biāo)本的質(zhì)量、抗體的效價(jià)影響，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性。SSP-PCR靈敏度和特異性均較好，但產(chǎn)物需電泳，操作繁瑣，且也有一定的假陽(yáng)性或假陰性。實(shí)時(shí)焚光定量 PCR 技術(shù)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 簡(jiǎn)稱Real Time PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA(or cDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法，分染料法和探針?lè)▋深悪z測(cè)方法。 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR在特異性引物的基礎(chǔ)上加入了一條與目的基因特異性匹配的探針(帶有熒光基團(tuán))，能顯著提高檢測(cè)的特異性，是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)及臨床醫(yī)學(xué)研究方面有著重要的意義。目前已有多種運(yùn)用探針?lè)ǘ縋CR技術(shù)的試劑盒應(yīng)用于臨床疾病相關(guān)的病原體檢測(cè)、基因分型、突變研究等。本試劑盒通過(guò)設(shè)計(jì)與HLA-B27基因完全匹配的1對(duì)特異性引物和1條Taqman水解熒光探針，用于快速準(zhǔn)確的檢測(cè)HLA-B27基因。該方法相比目前應(yīng)用于臨床的其它方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、省時(shí)、省力、成本低廉及高通量等優(yōu)點(diǎn)，可快速準(zhǔn)確的檢測(cè)患者 HLA-B27基因陰陽(yáng)性，用于臨床強(qiáng)直性脊柱炎、Reiter綜合癥、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎伴關(guān)節(jié)病、急性前葡萄膜炎等許多嚴(yán)重危害人類健康的脊柱性關(guān)節(jié)病的輔助診斷。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒。本專利技術(shù)還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述試劑盒的檢測(cè)方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下一種HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒，它包括(1) 1對(duì)擴(kuò)增HLA-B27的特異性引物，其特征在于如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 所示引物對(duì)；條HLA-B27特異性熒光探針，其特征在于如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列， 在其5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，在其3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ；在一次檢測(cè)中共同使用。上述HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA 提取液 A :0. 32M 蔗糖，IOmM Tris-HCl pH 7. 5,5mM MgCl2,0. 1 % (ν/ν) Triton X-100，室溫保存；(2) DNA 提取液 B:30mM Tricine pH 8.5，210mM 辛酸鈉，2. 5 % (m/v) Chelex-100，_20°C保存；(3)PCR反應(yīng)液0. 2 μ M引物對(duì)SEQ ID NO 1 和 2，0. 04 μ M熒光探針SEQ ID NO :3， 30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% (v/v)Tween-20,0. 01% (m/v)明膠，0· 03% (m/v)BSA,6. 5mM MgCl2, _20°C保存；(4) 5U/ μ ITaq DNA 聚合酶，_20°C保存；(5)陽(yáng)性對(duì)照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存；(6)陰性對(duì)照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存。一種HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒，它包括上述的所有核苷酸序列的堿基互補(bǔ)序列，也就是包括(1) 1對(duì)擴(kuò)增HLA-B27的特異性引物，其特征在于如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5 所示引物對(duì)；條HLA-B27特異性熒光探針，其特征在于如SEQ ID NO :6所示核苷酸序列， 在其5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，在其3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ；在一次檢測(cè)中共同使用。上述HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA 提取液 A :0. 32Μ 蔗糖，IOmM Tris-HCl pH 7. 5,5mM MgCl2,0. 1 % (ν/ν) Triton X-100，室溫保存；(2) DNA 提取液 B :30mM Tricine pH 8.5，210mM 辛酸鈉，2. 5 % (m/v) Chelex-100，_20°C保存；(3) PCR 反應(yīng)液0. 2μ M引物對(duì) SEQ ID NO :4 和 5，0. 04 μ M 熒光探針 SEQ IDNO :6， 30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% (v/v)Tween-20,0. 01% (m/v)明膠，0· 03% (m/v)BSA,6. 5mMMgCl2, _20°C保存；(4) 5U/ μ ITaq DNA 聚合酶，_20°C保存；(5)陽(yáng)性對(duì)照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存； (6)陰性對(duì)照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存。上述HLA-B27快速檢測(cè)的檢測(cè)方法包括如下步驟(1)提取外周血人基因組DNA ；(2)以步驟⑴所得DNA為模板，利用特異性引物和熒光探針進(jìn)行HLA-B27的檢測(cè)；(3)參考陰陽(yáng)性對(duì)照品，得出臨床標(biāo)本HLA-B27結(jié)果。步驟⑵中所述的熒光定量PCR檢測(cè)體系為PCR反應(yīng)液(0.2μΜ引物對(duì)SEQ IDNO I本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：商純爾，張偉林，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江夸克生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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