本發明專利技術提供一種熒光標記的O6-芐基鳥嘌呤，通過不同長度的醚狀連接鏈，在O6-芐基鳥嘌呤的芐基對位或間位引入了1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY熒光基團。本發明專利技術提供了一類用于在活細胞中標記功能態MGMT蛋白的小分子熒光探針。該類探針分子是依據MGMT的催化機理而設計的共價抑制劑，它們具有良好的細胞膜通透性，可對細胞內的MGMT產生抑制作用，并對其進行熒光標記，可在制備用于標記活細胞中活性態MGMT的探針分子中的應用；結構通式為：。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬化學藥物，涉及一類在活細胞中標記功能態MGMT蛋白的小分子熒光探針，其制備方法，以及用其進行標記的方法。該類探針是氟硼熒光染料(boron dipyrromethene B0DIPY)熒光基團修飾的O6-芐基鳥嘌呤類化合物，具有良好的細胞膜通透性以及對功能態MGMT蛋白的選擇性。在活細胞中，它們可以與功能態的MGMT蛋白結合， MGMT蛋白隨即催化探針分子結構中的BODIPY-芐基部分共價結合于MGMT第145位半胱氨酸的巰基上，導致功能態的MGMT失活，同時由于獲得BODIPY熒光基團而被標記，并能被定性定量檢測。
技術介紹
近年來，惡性腫瘤的發病率持續升高，已成為嚴重威脅人類生命的最大殺手之一。 目前，化療已成為臨床治療腫瘤的重要手段，而烷化劑作為傳統的化療藥物之一，因其低廉的價格而受到患者青睞，多年來仍然活躍在臨床抗腫瘤一線，是臨床化療方案中不可或缺的藥品。烷化劑在體內能形成缺電子活潑中間體或其它具有活潑親電性基團的化合物，進而與DNA中富電子基團發生共價結合，使DNA分子喪失活性或發生斷裂，從而誘導細胞凋亡。DNA結構中有許多可被烷基化的位點，各位點的反應活性不同，烷基化后所造成的損傷程度亦不相同，其中以鳥嘌呤O6-位烷基化所造成的損傷最為嚴重，是細胞中主要的致突變、致凋亡損傷。O6-甲基鳥嘌呤 DNA 甲基轉移酶(O6- methylguanine DNAmethyltransferase, MGMT)是從細菌到哺乳動物細胞中廣泛存在的DNA損傷修復酶，特異性修復DNA結構中鳥嘌呤O6-位的烷基化損傷。活性態MGMT在不需任何輔助因子或其它蛋白質的條件下，不可逆地催化DNA分子中鳥嘌呤O6-位上的烷基轉移至其第145位的半胱氨酸巰基上，使DNA的結構和功能恢復正常，同時自身獲得烷基而失活。MGTM的修復作用是細胞對烷化劑藥物產生耐藥性的根本原因。腫瘤細胞中MGMT 酶活性水平與細胞對烷化劑藥物的敏感性直接相關。因此，檢測并確定細胞中MGMT酶活水平的高低，有可能預見烷化劑類藥物的治療效果。但由于不同腫瘤細胞中MGMT的酶活水平差異較大，而同種腫瘤組織中MGMT酶活水平也存在顯著的個體差異，因此，建立分析腫瘤細胞中MGMT酶活水平的方法，對于實施腫瘤預見性個體化化療方案，合理使用化療藥物， 提高療效，具有重要的參考意義。已報導的MGMT酶活水平檢測方法包括標記DNA法、標記寡核苷酸法及單克隆抗體法。標記DNA法和標記寡核苷酸法利用標記的DNA或標記的寡核苷酸對MGMT 蛋白進行放射性標記。雖然這兩種方法都具有較高的靈敏性，但由于用到了放射性同位素， 因而對實驗條件要求較高，必須在專業實驗室內進行；另外，放射性同位素對環境產生的污染危害極大；再者，DNA及寡核苷酸作為生物分子，細胞膜通透性差，使得標記實驗只能在細胞勻漿液中進行；其次，標記DNA及標記寡核苷酸的制備過程復雜，穩定性差，不易于長期保存，這些都制約了上述兩種方法的廣泛應用。單克隆抗體法雖然避免了放射性同位素的應用，但抗體作為生物分子同樣具有細胞膜通透性差、穩定性差的缺點；更重要的是，抗體通過識別抗原表位與蛋白結合，因而結果并不能反映蛋白質的功能狀態。上述3種檢測方法，均由于檢測試劑的體積大、膜通透性差的缺點而被限制了在活細胞中的應用。與之相反，熒光標記的小分子探針則具有良好的細胞膜通透性，適宜在活細胞中的應用；熒光檢測基團與放射性同位素相比，無毒無害且靈敏性高；不僅如此，基于蛋白質的強效抑制劑而設計的小分子熒光探針將特異結合功能態的蛋白質，因而檢測結果能真實反映蛋白質在細胞中的功能態水平。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種熒光標記的O6-芐基鳥嘌呤，具有以下式I通式其中熒光基團的修飾位置位于芐基的間位或對位；m代表0-5的自然數；修飾用的焚光基團氟硼熒光染料(boron dipyrromethene, B0DIPY)選用1，3，5，7-四甲基-8-丁酰-BODIPY0 本專利技術的又一個目的是提供式I代表的熒光標記的O6-芐基鳥嘌呤的制備方法， 通過以下2種制備方法實現 制備方法(l)，m代表1-5 (A)芐位引入疊氮基醚鏈的苯甲酸乙酯中間體II的制備稱取適量疊氮基單取代的縮乙醇，溶于干燥四氫呋喃，加入1當量NaH，室溫攪拌5分鐘后，加入1當量對(或間)溴甲基 (或氯甲基)苯甲酸乙酯，繼續于室溫下反應3小時后，加水悴滅，粗產品以乙酸乙酯萃取，有機相濃縮后硅膠柱層析純化，體積比為3:1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，得無色油狀物II ；(B)芐醇中間體III的制備稱取適量的苯甲酸乙酯中間體II，溶于干燥四氫呋喃中， 加入1.5當量LiAlH4,回流攪拌反應3小時后，自然冷至室溫，加水悴滅，產品以乙酸乙酯萃取，減壓旋除溶劑后，濾液減壓濃縮得淡黃色油狀物。該油狀物繼而溶于無水乙醇中，依次加入1當量三乙胺及1當量三氟乙酸乙酯，室溫攪拌反應5小時后，減壓蒸除溶劑，粗產品以硅膠柱層析純化，石油醚/乙酸乙酯(K/Y = 1:1)洗脫，得無色油狀物III ；(C)芐基的對/間位引入醚狀連接鏈的O6-芐基鳥嘌呤中間體IV的制備稱取適量中權利要求1. 一種熒光標記的O6-芐基鳥嘌呤，具有以下式I通式:2.根據權利要求1所述的一種熒光標記的O6-芐基鳥嘌呤的制備方法，通過以下步驟實現(1)芐位引入疊氮基醚鏈的苯甲酸乙酯中間體II的制備稱取疊氮基單取代的縮乙醇，溶于干燥四氫呋喃，加入1當量NaH，室溫攪拌5分鐘后，加入1當量對或間溴甲基苯甲酸乙酯或者對或間氯甲基苯甲酸乙酯，繼續于室溫下反應3小時后，加水悴滅，粗產品以乙酸乙酯萃取，有機相濃縮后硅膠柱層析純化，體積比為3:1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，得無色油狀物II ；(2)芐醇中間體III的制備稱取苯甲酸乙酯中間體II，溶于干燥四氫呋喃中，加入1.5 當量LiAlH4,回流攪拌反應3小時后，自然冷至室溫，加水悴滅，產品以乙酸乙酯萃取，減壓旋除溶劑后，濾液減壓濃縮得淡黃色油狀物，該油狀物繼而溶于無水乙醇中，依次加入1當量三乙胺及1當量三氟乙酸乙酯，室溫攪拌反應5小時后，減壓蒸除溶劑，粗產品以硅膠柱層析純化，用體積比為1:1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，得無色油狀物III ；(3)芐基的對/間位引入醚狀連接鏈的O6-芐基鳥嘌呤中間體IV的制備稱取中間體 III，溶于干燥DMF中，加入1當量NaH，室溫攪拌5分鐘后，加入1當量的6-氯鳥嘌呤，繼續于室溫攪拌反應5小時，減壓蒸除溶劑，所得粗產品以硅膠柱層析純化，用體積比為30 1的二氯甲烷/甲醇洗脫，得無色膠狀物，即為中間體IV ；(4)探針分子I的合成稱取中間體IV溶于甲醇中，攪拌溶解后加入5當量的碳酸鉀， 反應液于60°C攪拌2小時后，冷至室溫，減壓蒸除溶劑，加入少量無水甲醇，濾除固體不溶物，濾液中依次加入1當量1，3，5，7-四甲基-8- 丁酰-BODIPY-tV-琥珀酰亞胺酯及1當量三乙胺，室溫攪拌3小時后，減壓蒸除溶劑，粗產品硅膠柱層析純化，用體積比為8:1的二氯甲烷/甲醇洗脫，得目的化合物Ia-I j，為磚紅色固體，合成路線如下3.根據權利要求1所述的一種熒光標記的O6-芐基鳥嘌呤的制備方法，通過以下步驟實現稱取06-鳥嘌呤或06-鳥嘌呤溶于干燥本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李新，胡永洲，楊波，何俏軍，錢石靜，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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