胃促胰酶的適配體及其用途制造技術

提供有：與胃促胰酶結合從而抑制胃促胰酶活性的適配體；包含由X1GAUAGAN1N2UAAX2代表的核苷酸序列的適配體，其中X1和X2是相同的或不同的并且每個是A或G，而N1和N2是相同的或不同的并且每個是A、G、C、U或T；包含所述適配體和功能物質(例如親和性物質、標記物質、酶、藥物遞送介質、藥物等)的復合物；包含所述適配體或復合物的藥物或試劑；使用所述適配體或復合物等檢測和純化胃促胰酶的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及胃促胰酶的適配體、相同適配體的利用方法等。專利技術背景人胃促胰酶(EC.3.4.21.39)，是一種胰凝乳蛋白酶類絲氨酸蛋白酶，其貯存在肥大細胞分泌顆粒中。當外界刺激時，肥大細胞經歷脫粒，導致人胃促胰酶連同多種炎癥介質一起釋放到細胞外。釋放的人胃促胰酶特異地識別包含在底物蛋白和肽中的芳香族氨基酸，諸如苯丙氨酸和酪氨酸，并且切割靠近所述氨基酸的肽鍵。人胃促胰酶的代表性底物是血管緊張肽I(AngI)。人胃促胰酶切割AngI從而產生血管緊張肽II(AngII)，血管緊張肽II是一種血管收縮因子。按系統發生哺乳動物胃促胰酶分類為兩個亞家族：α和β。靈長類，包括人，只表達一種屬于α家族的胃促胰酶。同時，嚙齒類表達α和β兩個家族的胃促胰酶。在小鼠中，有很多種胃促胰酶，其中屬于β家族的小鼠肥大細胞蛋白酶4(mMCP-4)，從其底物特異性和組織中的表達模式判斷，被認為是與人胃促胰酶最密切相關的。在倉鼠中，同樣屬于β家族的倉鼠胃促胰酶-1對應于人胃促胰酶。同時，和人胃促胰酶同屬α家族的mMCP-5和倉鼠胃促胰酶-2，具有彈性蛋白酶類活性并且在底物特異性方面與人胃促胰酶不同。胃促胰酶與轉化生長因子β(TGF-β)的激活極為相關。TGF-β以潛伏態(潛伏-TGF-β)存在于上皮細胞和內皮細胞周圍的細胞外基質中，并且通過大潛伏TGF-β結合蛋白(LTBP)保留在細胞外基質中。當需要并且被激活時TGF-β從細胞外基質釋放，并且激活的TGF-β是對活體極為重要的細胞因子，據報道其參與細胞增殖和分化以及組織損傷后的組織修復和再生。它的信號的衰弱導致多種疾病的發生和發展。據信在此過程中，胃促胰酶涉及潛伏TGF-β從細胞外基質的釋放以及潛伏TGF-β到活性TGF-β的轉化。已知胃促胰酶與眾多疾病相關，所述疾病包括纖維化、心血管疾病、炎癥、過敏性疾病和器官粘附(organ?adhesion)。纖維化是這樣的疾病，其特征為在肺、心、肝、腎、皮膚等中細胞外底物的異常代謝，導致結締組織蛋白的過度沉積。在肺纖維化中，例如，結締組織蛋白諸如膠原蛋白過度沉積在肺中，導致肺泡難以收縮以及隨后的呼吸窘迫。已經證明肺纖維化起因于由暴露于大量塵埃引起的肺塵埃沉著病、由使用藥物諸如抗癌藥劑引起的藥物誘導的肺炎、過敏性肺炎、肺結核、自身免疫疾病諸如諸如膠原蛋白病等。然而，有一些其中病因未知的情況。分子水平上的纖維化發生機制還未被闡明。通常，在正常狀態下，成纖維細胞的增殖和功能得到很好的控制。然而，在嚴重或持續炎癥或損傷的情況中，組織修復機制過度運行，導致成纖維細胞的異常增殖以及結締組織蛋白的超量生產。已知TGF-β是引起這些現象的因子。如表明其參與的證據，已經有報道向纖維化的動物模型給藥抗TGF-β中和抗體導致膠原蛋白表達的減少和纖維化的顯著抑制。在具有先天肺纖維化的患者中，觀察到TGF-β水平的增加和胃促胰酶陽性肥大細胞計數的提高。同時，胃促胰酶與纖維化的聯系已經由使用動物模型的實驗證明。在博來霉素誘導的肺纖維化的倉鼠模型中，胃促胰酶抑制劑顯著減小了促進的胃促胰酶活性、增加的膠原蛋白III?mRNA的表達、組織纖維化和其他現象。在博來霉素誘導的肺纖維化的小鼠模型中已經觀察到同樣作用；胃促胰酶抑制劑的給藥抑制胃促胰酶活性并且減少羥基脯氨酸的含量。可以使用具有這些特征的胃促胰酶抑制劑作為胃促胰酶相關疾病諸如纖維化的預防或治療藥物。已經開發出的胃促胰酶抑制劑包括小分子化合物諸如TPC-806、SUN-13834、SUN-C8257、SUN-C8077和JNJ-10311795(專利文獻1)。近年來，應用于治療藥物、診斷試劑和檢測試劑的RNA適配體已經引起人們的注意；一些RNA適配體已經處于臨床研究階段或實際使用中。在2004年十二月，世界上第一個RNA適配體藥物，Macugen，在美國被批準作為年齡相關性黃斑變性(age-related?macular?degeneration)的治療藥物。RNA適配體是指特異地結合目標分子諸如蛋白的RNA，并且能夠使用SELEX(指數富集的配體系統進化)方法來制備它(專利文獻2-4)。在SELEX方法中，特異結合目標分子的RNA選自具有大約1014個不同核苷酸序列的RNA庫。所用的RNA具有大約40個核苷酸的隨機序列，引物序列在所述隨機序列的側翼。允許此RNA庫與目標分子混合，并且只有與目標分子結合的RNA被使用過濾器等分離。通過RT-PCR擴增分離的RNA，并且使用此作為下一輪的模板。通過重復此操作大約10次，可以獲得特異結合目標分子的RNA適配體。與抗體藥物相似，適配體藥物能夠以細胞外蛋白為目標。根據眾多科學文章和公共領域中的其他參考材料，判斷適配體藥物在一些方面超過抗體藥物。例如，適配體與抗體相比通常展示較高的對目標分子的親和性和特異性。適配體不太可能遭受免疫清除，而作為抗體特性的逆反應，諸如依賴抗體的細胞介導的細胞毒性(ADCC)和依賴補體的細胞毒性(CDC)，據報道不太可能在使用適配體時發生。從藥物遞送的角度，由于它們的分子尺寸大約是抗體的十分之一，所以適配體可能遷移到組織，這使得更容易將藥物遞送到目標位點。因為適配體通過化學合成制備，它們允許位點選擇性化學修飾，并且能夠通過大量生產來降低成本。適配體的其他優勢包括長期貯存穩定性、耐熱性和耐溶劑性。同時，適配體的血液半衰期通常短于抗體的血液半衰期；然而，考慮到毒性此性質有時是有優勢的。由這些事實得出這樣的結論，即即使當以同樣分子為目標時，適配體藥物可能勝過抗體藥物。現有文獻專利文獻專利文獻1：USB6500835專利文獻2：WO91/19813專利文獻3：WO94/08050專利文獻4：WO95/07364專利技術概述本專利技術要解決的問題本專利技術關注于提供胃促胰酶的適配體和用于使用同樣適配體的方法等。解決問題的方法本專利技術人不懈地研究從而解決了上述問題并且成功地制備了用于胃促胰酶的優質適配體，其導致本專利技術的完成。因此，本專利技術提供以下各項：[1]與胃促胰酶結合從而抑制胃促胰酶活性的適配體。[2]根據[1]的適配體，所述適配體包含由X1GAUAGAN1N2UAAX2(SEQ?ID?NO：21；每個X1和X2，不管是否相同，是A或G，而每個N1和N2，不管是否相同，是A、G、C、U或T)代表的核苷酸序列。[3]根據[2]本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2009.06.11 JP 2009-1405851.與胃促胰酶結合從而抑制胃促胰酶活性的適配體。
2.根據權利要求1的適配體，所述適配體包含由
X1GAUAGAN1N2UAAX2(SEQ?ID?NO：21；X1和X2中的每個，不管是否
相同，是A或G，而N1和N2中的每個，不管是否相同，是A、G、C、U
或T)代表的核苷酸序列。
3.根據權利要求2的適配體，其中N1N2是GA、GU、GC、UU、GT
或CU。
4.根據權利要求2的適配體，其中X1和X2都是A或都是G。
5.根據權利要求3或4的適配體，其中至少一個嘧啶核苷酸已被修飾
或變更。
6.根據權利要求1的適配體，所述適配體包含以下核苷酸序列(a)、
(b)和(c)中的任何一個：
(a)適配體，所述適配體包含選自SEQ?ID?NO：4-34、38-57、59-65和
69-72(其中規定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列；
(b)適配體，所述適配體包含選自SEQ?ID?NO：4-34、38-57、59-65和
69-72(其中規定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列，其中1至5個核
苷酸被取代、缺失、插入或添加；和
(c)核苷酸序列，所述核苷酸序列與選自SEQ?ID?NO：4-34、38-57、
59-65和69-72(其中規定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70％
或更多的同一性。
7.根據權利要求6的適配體，其中至少一個包含在所述適配體中的核
苷酸已被修飾或變更。
8.根據權利要求1的適配體，所述適配體包含以下核苷酸序列(a’)、
(b’)和(c’)中的任何一個：
(a’)選自SEQ?ID?NO：56(1)-56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)-56(52)、
61(1)、69(1)、69(2)、和72(1)-72(8)(其中規定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的
核苷酸序列；
(b’)選自SEQ?ID?NO：56(1)-56(7)、56(9)、56(11)、5...

【專利技術屬性】
技術研發人員：中村義一，金玲，山崎聰子，池田壽子，村口正宏，
申請(專利權)人：力博美科股份有限公司，大塚制藥株式會社，
類型：發明
國別省市：