復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)細(xì)胞制造技術(shù)

本公開(kāi)提供產(chǎn)生用于基因治療的載體和病毒粒子的細(xì)胞系和方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)依據(jù)35U.S.C.§119要求2009年6月17日提出的臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/218,063的優(yōu)先權(quán)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考并入本文。
本公開(kāi)涉及產(chǎn)生重組的復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法、產(chǎn)生所述載體的細(xì)胞系以及產(chǎn)生和使用所述細(xì)胞系的方法。
技術(shù)介紹
逆轉(zhuǎn)錄病毒的生命周期包含病毒的遺傳物質(zhì)插入宿主細(xì)胞基因組中的階段。此步驟是必不可少的，因?yàn)椴迦氲牟《竞怂峒丛《臼峭ㄟ^(guò)宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)復(fù)制。作為該過(guò)程的一部分，逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA基因組在插入至宿主細(xì)胞基因組之前通過(guò)雙鏈DNA中間物復(fù)制。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶完成病毒RNA分子向雙鏈DNA(dsDNA)分子的最初轉(zhuǎn)變。然后dsDNA通過(guò)整合酶整合入宿主細(xì)胞基因組中，以通過(guò)宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)進(jìn)一步復(fù)制。RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sDNA和整合入宿主基因組所必需的逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶在感染期間在病毒粒子內(nèi)攜帶。原病毒DNA最終利用宿主機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)錄為多個(gè)RNA拷貝。這些RNA分子然后翻譯為病毒肽或蛋白質(zhì)，或整合入病毒粒子中，所述病毒粒子從細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基或細(xì)胞外環(huán)境中。逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組通常包含6個(gè)可表達(dá)多種蛋白質(zhì)的典型區(qū)域。這些區(qū)域包括gag、pol和env基因序列，其與包裝信號(hào)psi(ψ)信號(hào)有關(guān)且側(cè)翼為5′和/或3′長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)區(qū)域。gag基因可表達(dá)病毒核蛋白核心的蛋白質(zhì)組分，而pol基因產(chǎn)物與多核苷酸合成和重組相關(guān)。env基因編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子的包膜組分。5′和3′LTR區(qū)域包含啟動(dòng)子且?guī)椭《净蚪M整合入宿主細(xì)胞的染色體DNA中。psi信號(hào)是指逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)，其控制RNA有效地包裝入病毒粒子中。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒不能形成原病毒，因此逆轉(zhuǎn)錄病毒可用于修飾靶標(biāo)或宿主細(xì)胞的基因組，且可對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行各種修飾以用于基因治療治療。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因治療治療一般通過(guò)向編碼或產(chǎn)生目的多肽或轉(zhuǎn)錄物的病毒基因組中加入異源多核苷酸，將重組基因組包裝入病毒粒子和感染靶宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后靶細(xì)胞整合作為原病毒一部分的外源基因。已經(jīng)將大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體變成“有缺陷的”，以避免病毒粒子不受控制的傳播和生產(chǎn)。然而，關(guān)于復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)少有報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本公開(kāi)提供可用于產(chǎn)生用于基因治療的重組復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因治療的細(xì)胞系和病毒粒子生產(chǎn)細(xì)胞。本公開(kāi)提供用于產(chǎn)生復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，所述細(xì)胞系包括纖維肉瘤、骨肉瘤或胸腺瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包含gag基因、pol基因、env基因、異源多核苷酸和用于組裝所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒psi(Ψ)因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定表達(dá)復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，半衰期在2-8℃下大于7天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從細(xì)胞系產(chǎn)生的病毒粒子在細(xì)胞系于65℃下儲(chǔ)存12個(gè)月后顯示感染力無(wú)損失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的載體在3個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)大約100％穩(wěn)定，且以相同復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系所產(chǎn)生的相同載體在相同儲(chǔ)存條件下在2到8周時(shí)與起始滴度相比損失至少5倍活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒包含：逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白；逆轉(zhuǎn)錄病毒POL蛋白；逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜；逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸，其包含位于逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列3’端的長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列、位于逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸5’端的啟動(dòng)子序列(所述啟動(dòng)子適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá))、gag核酸結(jié)構(gòu)域、pol核酸結(jié)構(gòu)域和env核酸結(jié)構(gòu)域；序列盒，其包含有效連接于異源多核苷酸的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或調(diào)控核酸結(jié)構(gòu)域，其中所述序列盒位于3’LTR的5’和編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜的env核酸結(jié)構(gòu)域的3’；和在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄、包裝和整合所必需的順式作用序列。其中與pACE載體相比，RCR在6次傳代后保持較高的復(fù)制能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列來(lái)源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)或長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GALV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GALV)、狒狒內(nèi)源性病毒(BEV)和貓病毒RD114。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MLV是雙嗜性MLV。在另一個(gè)實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是γ逆轉(zhuǎn)錄病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸調(diào)節(jié)域包含pol?II啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列包括組織特異性啟動(dòng)子序列，例如雄激素反應(yīng)元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，雄激素反應(yīng)元件來(lái)源于probasin啟動(dòng)子。生產(chǎn)者細(xì)胞系所產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含多種結(jié)構(gòu)域。例如，啟動(dòng)子包括具有如SEQ?ID?NO：19、20或22的核苷酸1到約核苷酸582所闡述的序列的CMV啟動(dòng)子，且可包含對(duì)一個(gè)或一個(gè)以上核酸堿基的修飾，所述修飾能指導(dǎo)和引發(fā)轉(zhuǎn)錄；CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核苷酸包含如SEQ?ID?NO：19、20或22的約核苷酸1到約核苷酸1202所闡述的序列，或與如SEQ?ID?NO：19、20或22所闡述的序列具有至少95％同一性的序列，其中所述多核苷酸促進(jìn)與其有效連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄；gag核酸結(jié)構(gòu)域包含SEQ?ID?NO：19或22的約核苷酸1203到約核苷酸2819的序列，或與其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列；pol結(jié)構(gòu)域包含SEQ?ID?NO：19或22的約核苷酸2820到約核苷酸6358的序列，或與其具有至少95％、98％、99％或99.9％同一性的序列；env結(jié)構(gòu)域包含SEQ?ID?NO：19或22的約核苷酸6359到約核苷酸8323的序列，或與其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列；IRES包含SEQ?ID?NO：19或22的約核苷酸8327到約核苷酸8876的序列，或與其具有至少95％、98％或99％同一性的序列；且異源核酸包括具有如SEQ?ID?NO：3、5、11、13、15或17所闡述的序列的多核苷酸。本公開(kāi)還提供一種無(wú)細(xì)胞制劑，其包含從本文所述的產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞系獲得的病毒粒子。在一些實(shí)施方案中，從分離的病毒粒子制備藥物制劑。本公開(kāi)還提供一種產(chǎn)生本文所述的產(chǎn)生載體細(xì)胞系的方法，其包括用編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化293細(xì)胞系，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體從5’到3’包含：人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子與MLV?R-U5區(qū)的CMV-R-U5融合體；逆轉(zhuǎn)錄酶的引物結(jié)合位點(diǎn)PBS；5’剪接位點(diǎn)；ψ包裝信號(hào)；MLV組特異性抗原本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】2009.06.17 US 61/218,0631.一種用于產(chǎn)生復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，所述細(xì)
胞系包括纖維肉瘤、骨肉瘤或胸腺瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)重組逆轉(zhuǎn)錄
病毒基因組，所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包含gag基因、pol基因、env基因、
異源多核苷酸和用于組裝所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒psi(Ψ)因
子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄
病毒粒子穩(wěn)定表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中半衰期在2-8℃下大
于7天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中產(chǎn)生的載體在3個(gè)
月或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)大約100％穩(wěn)定，且用相同復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系
所產(chǎn)生的相同載體在相同儲(chǔ)存條件下在2到8周時(shí)與起始滴度相比活性損失至
少5倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄
病毒包含：
逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白；
逆轉(zhuǎn)錄病毒POL蛋白；
逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜；
逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸，其包含：在所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列的3’端的
長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列；在所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸的5’端的啟動(dòng)子序列，
所述啟動(dòng)子適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)；gag核酸結(jié)構(gòu)域；pol核酸結(jié)構(gòu)域；和
env核酸結(jié)構(gòu)域；
序列盒，其包含有效連接于異源多核苷酸的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)
或調(diào)節(jié)核酸結(jié)構(gòu)域，其中所述序列盒位于所述3’LTR的5’和編碼所述逆轉(zhuǎn)錄病
毒包膜的所述env核酸結(jié)構(gòu)域的3’；和
在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄、包裝和整合所必需的順式作用序列，
其中與pACE載體相比，所述RCR在6次傳代后保持更高的復(fù)制能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多
核苷酸序列來(lái)源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)或
長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GALV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、
長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GALV)、狒狒內(nèi)源性病毒(BEV)和貓病毒RD114。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述MLV是
雙嗜性MLV。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是
γ逆轉(zhuǎn)錄病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述啟動(dòng)子序列與
生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因有關(guān)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述啟動(dòng)子序列
包括組織特異性啟動(dòng)子序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述組織特異
性啟動(dòng)子序列包含至少一個(gè)雄激素反應(yīng)元件(ARE)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述雄激素反
應(yīng)元件是來(lái)源于probasin啟動(dòng)子。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述組織特異
性啟動(dòng)子序列包括probasin啟動(dòng)子。
14.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述啟動(dòng)子包括
具有如SEQ?ID?NO：19、20或22的核苷酸1到約核苷酸582所闡述的序列的CMV
啟動(dòng)子，且可包含對(duì)一個(gè)或一個(gè)以上核酸堿基的修飾，所述修飾能指導(dǎo)和引發(fā)
轉(zhuǎn)錄。
15.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述啟動(dòng)子包含
如SEQ?ID?NO：19、20或22的核苷酸1到約核苷酸582所闡述的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述啟動(dòng)子包含
CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述
CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域包含與MLV?R-U5區(qū)域連接的來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的立即早期
啟動(dòng)子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述
CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核苷酸包含如SEQ?ID?NO：19、20或22的約核苷酸1到約
核苷酸1202所闡述的序列，或與如SEQ?ID?NO：19、20或22所闡述的序列具
有至少95％同一性的序列，其中所述多核苷酸促進(jìn)與其有效連接的核酸分子的
轉(zhuǎn)錄。
19.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述多核苷酸的
gag來(lái)源于γ逆轉(zhuǎn)錄病毒。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述gag核酸
結(jié)構(gòu)域包含SEQ?ID?NO：19或22的約核苷酸1203到約核苷酸2819的序列，或
與其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述多核苷酸的
pol結(jié)構(gòu)域來(lái)源于γ逆轉(zhuǎn)錄病毒。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述pol結(jié)構(gòu)
域包含SEQ?ID?NO：19或22的約核苷酸2820到約核苷酸6358的序列，或與其
具有至少95％、98％、99％或99.9％同一性的序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述env結(jié)構(gòu)域
包含SEQ?ID?NO：19或22的約核苷酸6359到約核苷酸8323的序列，或與其具
有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，其中所述IRES來(lái)源
于腦心肌炎病毒...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：道格拉斯·J·喬利，C·伊巴尼斯，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：托卡根公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：