本發明專利技術公開了一種快速、雙效的基于PCR的方法，該方法采用單個實時PCR反應來鑒別如糞便或環境(土壤、水)分離物的提取樣本中兩種或更多種病原體(包括賈第蟲屬和/或隱孢子蟲屬)。該方法對獸醫臨床和環境測試應用是特別有用的。與基于ELISA或JFA的常規檢測方法相比，本方法更加靈敏。本發明專利技術還公開了在基于PCR的核酸檢測方法中使用的內對照(IC)。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術公開的內容涉及一種PCR方法，該方法使得可以在單個測定中檢測病原體，特別是賈第蟲屬(Giardia)和隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)，的任何組合。
技術介紹
賈第蟲屬是原生動物寄生蟲，是腹瀉性痢疾遍及全世界的主要原因。賈第蟲屬的最普通物種是蘭伯氏賈第蟲(G. lamblia)，它是南美最常見的病原寄生物(Meyer和 Jarrol (1980) Am. J. Epidemiol. 3 :1-12)。賈第蟲屬有兩個生命期。滋養體階段棲息于宿主動物的小腸，使用鞭毛到處移動。吸盤使滋養體附著到腸壁上，同時其以粘液分泌為食。第二生命期，孢囊，具有更堅固的外層，因此，在宿主間流通時比滋養體更加能夠在宿主外部存活。通常通過被賈第蟲屬污染的供水(Meyer和Jarrol，見上文)，或者人對人地進行傳播(Black 等人(1977) Pediatrics 60:486-491)。蘭伯氏賈第蟲滋養體的細胞骨架包含一組^_38kDa蛋白質(通常所說的賈第素(giardin)) (Peattie 等人(1989) J. Cell Biol. 109 :2323-2335)。幾種賈第素(包括α-1-賈第素和α-2-賈第素)的核酸序列是眾所周知的，α-1-賈第素和α _2_賈第素在核酸水平具有81 %的同一性，并且氨基酸序列具有77 %的同一性(Alonso和 Peattie (1992)Mol. Biochem. Parasitol. 50 :95-104)。已在蘭伯氏賈第蟲營養體的膜和盤上識別了 α -1-賈第素(Wenman 等人(1993) Parasitol. Res. 79 :587-592)。傳統上，通過用顯微鏡檢測糞便中的卵和寄生蟲(0&P)來診斷賈第蟲屬感染，這是一種繁復的過程。最近開發的賈第蟲屬診斷方法包括抗賈第蟲屬抗體的血清學試驗。然而，發現在血清中抗賈第蟲屬抗體的存在與有效的賈第蟲屬感染之間關連甚少。其他的診斷方法包括檢測糞便樣本中的賈第蟲屬抗原。例如，Green等人論述了通過給兔子接種完整滋養體或破裂滋養體和孢囊而建立的親和純化的抗血清的用途(Green等人(1985) Lancet 2 :691-693)。其他研究小組已描述了與賈第蟲病患者的糞便中釋放的65kDa抗原結合的單特異性抗體的用途(Rosoff 和 Stibbs (1986) J. Clin. Microbiol. 24 :1079-1083 ；U. S. Pat. No.5, 503, 983 ；Stibbs (1989)J. Clin. Microbiol. 27 :2582-2588 ；Rosoff 等人(1989) J. Clin. Microbiol. 27 :1997-2002)。Lujan 等人(1995) J. Biol. Chem. 270 :29307-29313 論述了與兩種賈第蟲屬孢囊壁成分結合的單克隆抗體。蘭伯氏賈第蟲的ELISA測定法論述在，例如，Nash 等人(1987) J. Clin. Microbiol. 25 :1169-1171, Stibbs 等人(1988) J. Clin. Microbiol. 26 :1665-1669，以及 Ungar 等人(1984) J. Infect. Dis. 149 :90-97 中。先前描述的檢測賈第蟲屬感染的測定法常常具有缺點。例如，已報道Ungar等人的測定法未能檢測8%的陽性樣本并且不能通過直接的目視檢查而被讀出(Green等人，見上文)。蘭伯氏賈第蟲(Giardia lamblia)是唯一已知的在人類中引起疾病的屬種。一些爭論仍然圍繞著也與十二指腸賈第鞭毛蟲(Giardia duodenal is)或腸賈第蟲(Giardia intestinalis)有關的物種的分類系統(Lu 等人 1998Molecular comparison of Giardia lamblia isolates. Int. J. Parasito 1. 28 :1341-1345)。迄今描述的賈第蟲屬種類的其他代表為來自兩棲動物的快捷賈第蟲(Giardia agilis)和來自嚙齒動物、禽類和爬行動物的鼠賈第蟲(Giardia muris) (Meyer 1994Giardia as an organism. P 3-13. In :RCA. Thompson, J.A. Reynoldsen, A.J.Lymbery(eds. )Giardia :From molecules to disease. CAB International, Wallingford, Oxon, UK)，來自蒼鷺的蒼鷺賈第蟲(Giardia ardea) (Erlandsen 等人 1990 Axenic culture and characterization of Giardia ardea from the great blue heron (Ardea herodias) (J. Prasitol. 76 :717-724)，以及來自廣鼠禾口田鼠的田鼠賈第蟲(Giardia microti) (van Keulen等人1998)。賈第蟲屬小亞基rRNA的序列顯示田鼠和麝鼠被一種特有的物種田鼠賈第蟲(Giardia microti)寄生(J. Parasitol. 84 294-300)。單克隆抗體(mabs)是檢測水樣本中的賈第蟲屬孢囊的最重要且廣泛應用的工具。絕大多數的商售抗體在其檢測所有賈第蟲屬物種(包括不感染人類的物種)時顯示出缺乏特異性。由于陽性抗體反應不會得到關于孢囊的生活力(傳染性)的任何結論，所以必須將活性染色(DAPI，PI)與抗體聯合使用。通過用于卵囊的排泄物涂片的光學顯微鏡檢查或者通過使用隱孢子蟲屬特異性寡核苷酸引物的聚合酶鏈式反應(PCR)分析排泄物樣本來檢測隱孢子蟲屬。例如，在De Leon等人的第5，770，368號美國專利中公開了一種檢測具硬殼形式的有活力且有傳染性的隱孢子蟲屬的方法。該方法包括分離卵囊，誘導熱休克蛋白(HSP)基因的轉錄，以及通過 RT-PCR檢測所誘導的轉錄物。或者，通過在易感細胞上培養隱孢子蟲屬以及通過PCR從受感染細胞中擴增HSP DNA或者誘導HSP轉錄以及通過RT-PCR檢測所誘導的轉錄物來測定傳染性。PCR通常被認為是最靈敏和快速的檢測特定樣本中的病原體核酸的方法。PCR 是本領域眾所周知的，并且已在Mullis等人的第4，683，195號美國專利、Mullis的第4，683，202號美國專利、AtIas等人的第5，298, 392號美國專利以及Burg等人的第 5，437，990號美國專利中描述。在PCR步驟中，提供用于每個靶病原體的寡核苷酸引物對， 其中，每個引物對包括與在所述靶核酸序列的5'末端的側翼的序列互補的第一核苷酸序列和與在所述靶核酸序列的3'末端的側翼的核苷酸序列互補的第二核苷酸序列。每個寡核苷酸引物對的核苷酸序列特異性針對要檢測的特定病原體并且不與其他病原體發生交叉反應。有多種不可互換的實時PCR(real time PCR)平臺用在臨床實驗室中。一些，例如，Ro本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：克里斯特爾·艾森奧爾，伊麗莎白·J·科爾曼，布萊恩·V·洛亞爾，
申請(專利權)人：肺結核診斷公司，
類型：發明
國別省市：
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