針對流感病毒的中和分子制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及鑒別、制備和工程化針對甲型流感病毒的中和抗體的方法和手段以及所制備的中和抗體。具體來說，本發(fā)明專利技術(shù)涉及針對各種甲型流感病毒亞型的中和抗體，和制備所述抗體的方法和手段。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及鑒別、制備和工程化針對甲型流感病毒的中和分子的方法和手段以及所制備的中和分子。本專利技術(shù)還涉及所制備的分子的各種用途，包括利用靶甲型流感病毒上的本專利技術(shù)的中和分子的結(jié)合位點來設(shè)計和生產(chǎn)疫苗。
技術(shù)介紹
流感是由流感病毒引起的傳染性呼吸道疾病。其引起輕度至重度疾病，且有時會導(dǎo)致死亡。美國每年有5-20%的人口染上流感，約200，000人住院，且引起約36，000人死亡。流感病毒通過咳嗽和打噴嚏所產(chǎn)生的呼吸飛沫傳播，其通常在人之間傳播。對流感表面抗原(尤其是血凝素)的免疫降低感染的可能性和疾病的嚴重性(如果發(fā)生感染)。 雖然有流感疫苗可用，但因為針對一種流感病毒類型或亞型的疫苗對于保護免于另一類型或亞型的流感有限或無效，所以有必要在每年的流感疫苗中并入一種或多種新菌株。流感病毒是片段型負鏈RNA病毒且屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族。甲型流感病毒由9種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成且另外編碼一種具有調(diào)節(jié)功能的非結(jié)構(gòu)NSl蛋白質(zhì)。非結(jié)構(gòu)NSl蛋白質(zhì)在復(fù)制周期期間大量合成且定位于受感染細胞的細胞溶質(zhì)和細胞核中。病毒基因組的片段性質(zhì)使得在細胞受不同病毒菌株混合感染期間發(fā)生基因重排(基因組片段的交換)的機制。依據(jù)其表面上所呈現(xiàn)的不同血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)病毒蛋白質(zhì)，甲型流感病毒可進一步分為各種亞型。通過兩種病毒表面糖蛋白，血凝素(HA或H)和神經(jīng)氨酸酶(NA或N)，來鑒別甲型流感病毒亞型。各流感病毒亞型通過它的H和N蛋白質(zhì)的組合來鑒別。有16種已知的HA亞型和9種已知的NA亞型。甲型流感病毒可感染人、禽類、豬、馬和其它動物，但野生禽類是這些病毒的天然宿主。雖然目前僅一些甲型流感亞型 (即，H1N1、H1N2和H3N》在人群中傳播，但在鳥類物種，尤其野生水禽和沙禽中已鑒別到 16種H和9種NA亞型的所有組合。另外，越來越多的證據(jù)表明，H5和H7流感病毒也可引起人疾病。甲型流感病毒的HA包含兩個結(jié)構(gòu)不同的區(qū)，S卩，球狀頭部區(qū)和莖部區(qū)。球狀頭部區(qū)含有負責(zé)病毒附著于靶細胞且參與HA的血細胞凝集活性的受體結(jié)合位點。莖部區(qū)含有對于病毒包膜與細胞內(nèi)吞體膜之間的膜融合所必需的融合肽，且因此與融合活性有關(guān) (Wiley 等，Ann. Rev. Biochem.，56 :365-394 (1987))。大流行是全球性疾病爆發(fā)。當新甲型流感病毒(1)出現(xiàn)，而人群體對此幾乎沒有免疫性，(2)開始引發(fā)嚴重疾病，并接著(3)在世界范圍內(nèi)容易地在人之間傳播時，則發(fā)生流感大流行。20世紀期間，曾有三次這樣的流感大流行。第一次，在1918年，“西班牙流感” 流感大流行，引起美國至少500，000人死亡且在世界范圍內(nèi)多達40，000, 000人死亡。這次大流行由甲型流感Hmi亞型引起。第二次，在1957年，“亞洲流感”流感大流行，由甲型流感H2N2亞型引起，導(dǎo)致美國至少70，000人死亡，且在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致1_2百萬人死亡。最近，在1968年，“香港流感”流感大流行，由甲型流感H3N2亞型引起，導(dǎo)致美國約34，000人死亡且在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致700，000人死亡。在1997年，香港報道了第一起甲型流感H5m病例。雖然這是這一類型的鳥類病毒第一次直接感染人，但是未發(fā)生大流行，因為未觀察到人之間的傳播。Lu 等，Resp. Res. 7 :43(2006) (doi :10. 1186/1465-992-7-43)報道從接種滅活的H5m病毒的疫苗的馬制備抗H5migG，和制備H5m特異性F(ab' )2片段，描述所述抗 H5NlIgG和H5m特異性F(ab' )2片段可保護感染有H5W病毒的BALB/c小鼠。Hanson等，Resp. Res. 7 :126(doi :10. 1186/1465-9921-7-126)描述對甲型流感H5 病毒血凝素具有特異性的嵌合單克隆抗體用于小鼠的被動免疫的用途。2008年1月17日公布的美國申請公布第20080014205號公開了針對流感病毒的中和抗體。鑒于由某些甲型流感病毒引起的呼吸道疾病的嚴重性和潛在大流行的威脅，極需要有效的預(yù)防和治療方法。本專利技術(shù)通過提供針對所述病毒的各種H亞型的甲型流感中和分子解決這一需要，所述H亞型包含但不限于甲型流感病毒的Hl和H3亞型以及H5亞型。本專利技術(shù)還提供能夠中和甲型流感病毒的給定亞型的一種以上且優(yōu)選所有分離株(菌株)的分子，所述分離株包含但不限于從各種人和非人物種獲得的分離株和來自各種流感流行病和 /或大流行的受害者和/或存活者的分離株。所述交叉反應(yīng)性中和分子可用于預(yù)防和/或治療流感病毒感染，包括已感染或有風(fēng)險感染流行病或大流行的人群的被動免疫。另外，交叉反應(yīng)性抗體可用作未來疫苗發(fā)現(xiàn)的設(shè)計指導(dǎo)和當前疫苗臨床開發(fā)的評估工具。專利技術(shù)概要在一方面，本專利技術(shù)提供包含來自重鏈和輕鏈多肽的高變區(qū)的結(jié)合分子。在一個實施方案中，結(jié)合分子包含一個、兩個或三個選自由SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :8和SEQ ID NO: 9組成的組的來自重鏈的高變區(qū)序列，或其功能活性片段。在另一實施方案中，結(jié)合分子包含所有高變區(qū)序列SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9。在一個其它實施方案中， 結(jié)合分子是當與輕鏈締合時能夠結(jié)合靶標的結(jié)合分子。在一個實施方案中，輕鏈或結(jié)合分子包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 13,SEQ ID N0:14和SEQ ID NO: 15。在另一實施方案中，輕鏈或結(jié)合分子包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:17和SEQ ID NO :18。在一個其它實施方案中，輕鏈或結(jié)合分子包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 19,SEQ ID N0:20和SEQ ID N0:21。在另一實施方案中，輕鏈或結(jié)合分子包含所有高變區(qū)序列SEQ ID NO :13、SEQ ID NO 14和SEQ ID NO :15ο在另一實施方案中，輕鏈或結(jié)合分子包含所有高變區(qū)序列SEQ ID NO 16、SEQ ID Ν0:17和SEQ ID NO 18。在一個其它實施方案中，輕鏈或結(jié)合分子包含所有高變區(qū)序列 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20 禾口 SEQ ID N0:21。在另一實施方案中，結(jié)合分子包含一個、兩個或三個選自由SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11和SEQ ID NO :12組成的組的來自重鏈的高變區(qū)序列，或其功能活性片段。在一個其它實施方案中，結(jié)合分子包含所有高變區(qū)序列SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11和SEQ ID N0: 12。在一個其它實施方案中，結(jié)合分子是當與輕鏈締合時能夠結(jié)合靶標的結(jié)合分子。在一個實施方案中，輕鏈或結(jié)合分子包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 22, SEQ ID N0:23和SEQ ID NO :24。在一其它實施方案中，輕鏈或結(jié)合分子包含所有高變區(qū)序列 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23 和 SEQ ID NO :24。在一個實施方案中，結(jié)合分子是抗體。在另一實施方案中，結(jié)合分子是替代抗體 (surr本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2009.05.13 US 61/177,987;2009.07.23 US 61/228,1141.一種結(jié)合分子，其包含一個、兩個或三個選自由SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8和SEQ ID NO 9組成的組的來自重鏈的高變區(qū)序列，或其功能活性片段。2.一種結(jié)合分子，其包含一個、兩個或三個選自由SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11和SEQ ID NO 12組成的組的來自重鏈的高變區(qū)序列，或其功能活性片段。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其包含來自SEQID N0:7、SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 9的所有高變區(qū)序列，或其功能活性片段。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合分子，其包含來自SEQID NO 10,SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 12的所有高變區(qū)序列，或其功能活性片段。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，當與輕鏈締合時其能夠結(jié)合靶標。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合分子，當與輕鏈締合時其能夠結(jié)合靶標。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子，其中所述輕鏈包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 13, SEQ ID N0:14或SEQ ID NO :15，或其功能活性片段。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子，其中所述輕鏈包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:17或SEQ ID NO 18，或其功能活性片段。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子，其中所述輕鏈包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列 SEQ ID NO :19、SEQ ID NO 20 或 SEQ ID NO :21。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合分子，其中所述輕鏈包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23或SEQ ID NO :24，或其功能活性片段。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的結(jié)合分子，其包含所有高變區(qū)序列SEQID NO 13, SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 15，或其功能活性片段。12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的結(jié)合分子，其包含所有高變區(qū)序列SEQID NO 16, SEQ ID NO 17或SEQ ID NO 18，或其功能活性片段。13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的結(jié)合分子，其包含所有高變區(qū)序列SEQID NO 19, SEQ ID NO 20或SEQ ID NO :21，或其功能活性片段。14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)合分子，其包含所有高變區(qū)序列SEQID NO 22, SEQ ID NO 23或SEQ ID NO :24，或其功能活性片段。15.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合分子，其還包含含有VpreB序列和/或λ5序列的多肽，或其功能活性片段。16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合分子，其還包含含有與λ5序列融合的VpreB序列的多肽，或其功能活性片段。17.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合分子，其還包含含有Vκ樣和/或JCk序列的κ 樣替代輕鏈(SLC)構(gòu)建體，或其功能活性片段。18.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合分子，其是抗體或其功能活性片段。19.一種結(jié)合分子，其包含重鏈，所述重鏈包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或其功能活性片段。20.一種結(jié)合分子，其包含重鏈，所述重鏈包含如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或其功能活性片段。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的結(jié)合分子，其還包含輕鏈，所述輕鏈包含選自由SEQID NO :3、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5組成的組的氨基酸序列，或其功能活性片段。22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合分子，其還包含輕鏈，所述輕鏈包含如SEQID NO :6所示的氨基酸序列，或其功能活性片段。23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其(i)中和甲型流感病毒的一種以上亞型和/或一種以上分離株，(ii)結(jié)合所述病毒的血凝素(HA)抗原，和(iii)抑制血細胞凝集。24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其(i)中和甲型流感病毒的至少一種亞型和/或至少一種分離株，和(ii)結(jié)合所述病毒的血凝素(HA)抗原。25.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其結(jié)合HA抗原的Hl 亞型的表位。26.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其結(jié)合HA抗原的H3 亞型的表位。27.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其結(jié)合HA抗原的Hl 亞型的表位和HA抗原的H3亞型的表位。28.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其結(jié)合HA抗原的H9 亞型的表位。29.根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其結(jié)合HA抗原的H5亞型的表位。30.根據(jù)權(quán)利要求25-29中任一項所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其中所述表位呈現(xiàn)于甲型流感病毒的表面上。31.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其可與HlHA抗原和 H3抗原交叉反應(yīng)。32.根據(jù)權(quán)利要求19所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其中和Hl和H3甲型流感病毒亞型中的至少一者。33.根據(jù)權(quán)利要求19所述的結(jié)合分子，或其功能活性片段，其中和Hl和H3甲型流感病毒亞型。34.根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合分子，其中和所述HlHA抗原，或其功能活性片段。35.根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合分子，其中和所述H5HA抗原，或其功能活性片段。36.根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合分子，其中和所述Hl和H5甲型流感病毒亞型，或其功能活性片段。37.根據(jù)權(quán)利要求25所述的結(jié)合分子，其中所述Hl亞型是，或所述HA來自Hl病毒的新喀里多尼亞/20/99分離株，或其功能活性片段。38.根據(jù)權(quán)利要求25所述的結(jié)合分子，其中所述Hl亞型是，或所述HA來自Hl病毒的索羅門群島/3/06分離株，或其功能活性片段。39.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的結(jié)合分子，其中所述H3亞型是，或所述HA來自H3病毒的威斯康星州/67/05分離株，或其功能活性片段。40.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的結(jié)合分子，其中所述H3亞型是，或所述HA來自H3病毒的香港/68分離株，或其功能活性片段。41.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的結(jié)合分子，其中所述H9亞型是，或所述HA來自H9病毒的香港/1073/99分離株，或其功能活性片段。42.根據(jù)權(quán)利要求四所述的結(jié)合分子，其中所述H5亞型是，或所述HA來自H5病毒的越南/1203/04分離株，或其功能活性片段。43.根據(jù)權(quán)利要求23所述的結(jié)合分子，其阻止所述甲型流感病毒的所述球狀頭部區(qū)結(jié)合細胞的表面，或其功能活性片段。44.根據(jù)權(quán)利要求23所述的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：L霍羅維茨，R巴特，A卡什亞普，
申請(專利權(quán))人：航道生物技術(shù)有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：