一種含有D型氨基酸的雙羰基還原酶的突變體的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種制備含D型賴氨酸的蛋白質(zhì)和多肽的方法：在表達(dá)性質(zhì)粒的特定酶切多克隆位點(diǎn)引入了目的蛋白的表達(dá)基因，并且將所述表達(dá)基因的目的位點(diǎn)突變成為T(mén)AG密碼子；在該表達(dá)性質(zhì)粒的另一個(gè)特定酶切多克隆位點(diǎn)引入ph氨酰tRNA合成酶的序列，得到重組質(zhì)粒；制備pAC-ph△-AK3質(zhì)粒；由pAC-ph△-AK3質(zhì)粒和重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到宿主中，得到表達(dá)系統(tǒng)；在培養(yǎng)基中添加D型賴氨酸，誘導(dǎo)上述表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白，純化得到目的蛋白。利用來(lái)源于Pyrococcushorikoshii的賴氨酰tRNA合成酶、抑制型tRNA分子對(duì)對(duì)D型賴氨酸能專一選擇琥珀密碼子TAG的特性在雙羰基還原酶中定點(diǎn)引入D型賴氨酸，引入效率接近100%，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，涉及一種制備含有D型氨基酸的蛋白質(zhì)和/或多肽的方法。
技術(shù)介紹
在蛋白質(zhì)和多肽中引入非天然氨基酸使其獲得新的性質(zhì)是一種已經(jīng)廣泛運(yùn)用于蛋白質(zhì)多肽類藥物修飾和制備生物材料等領(lǐng)域的策略。現(xiàn)今能夠在蛋白質(zhì)多肽中引入非天然氨基酸的方法主要包括3種:(I)多肽固相合成法。Merrifield首先采用的多肽固相分步合成方法將D型氨基酸與精氨酸類似物引入到促黃體素釋放素中(參見(jiàn)=Science.1965; 150:178-85.)。該方法能在小于100個(gè)殘基的多肽中任意位置引入非天然氨基酸。但是具有僅限于合成小于100個(gè)氨基酸殘基的短肽和需要繁瑣的保護(hù)和去保護(hù)等步驟等缺點(diǎn)。(2)體外蛋白質(zhì)翻譯。Larisa M等利用S30體外蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)在二氫葉酸還原酶和熒光素酶中成功引入D-Met and D-Phe (參見(jiàn)J.Am.Chem.Soc.2003 ;125:6616-7.)。但是該方法具有效率低、成本高和不能放大等缺點(diǎn)。(3)遺傳密碼擴(kuò)充方法。Schultz等人通過(guò)在活細(xì)胞中定向進(jìn)化外源的tRNA和氨酰tRNA合成酶分子對(duì)，將一系列的L型非天然氨基酸通過(guò)活細(xì)胞的核糖體蛋白合成系統(tǒng)引入到蛋白質(zhì)中(參見(jiàn)=S cience.2001;292:498-500.)。通過(guò)該非天然氨基酸引入技術(shù)獲得了一系列具有新性質(zhì)的蛋白質(zhì)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域，如:1.在蛋白中引入帶熒光氨基酸用于細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白定位；2.引入帶酮基團(tuán)的非天然氨基酸用于點(diǎn)擊化學(xué)的研究；3.引入含酮基和疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸用于蛋白質(zhì)多肽藥物的定點(diǎn)修飾。4.引入帶乙酰、甲基等非天然氨基酸用于模擬細(xì)胞內(nèi)乙酰化和甲基化等翻譯后修飾。雖然遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)能定點(diǎn)在任意大小的蛋白中引入100多種L型非天然氨基酸，相比前人的技術(shù)有重大的突破，但是該技術(shù)還是不能滿足人們希望通過(guò)改變氨基酸手性來(lái)定點(diǎn)修飾和改造蛋白質(zhì)和多肽的要求。因此，開(kāi)發(fā)一種有效地在任意大小的蛋白中引入D型氨基酸的方法為定點(diǎn)修飾蛋白質(zhì)和多肽類藥物、研究老年疾病的病理、制備新型的生物材料和定點(diǎn)修飾改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)等領(lǐng)域均具有重大意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的專利技術(shù)目的是提供一種大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，利用該大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)可在雙羰基還原酶的任意位點(diǎn)引入D型賴氨酸，為制備含D型賴氨酸的多肽和/或蛋白質(zhì)提供了新的方法。本專利技術(shù)的原理為:通過(guò)在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)一對(duì)來(lái)源于Pyrococcushorikoshii的賴氨酰tRNA合成酶和抑制型tRNA的分子對(duì),通過(guò)氯霉素抑制實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)水解及手性高效液相分析等方法證明了該分子對(duì)在含D型賴氨酸培養(yǎng)基中對(duì)D型賴氨酸的偏好，并利用這種偏好性在雙羰基還原酶的非活性位點(diǎn)定點(diǎn)引入了D型賴氨酸，引入效率接近100%。為達(dá)到上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是:一種大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，所述大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)含有帶有P15A復(fù)制子的pAC-ph Δ -AK3質(zhì)粒和帶有ColEl復(fù)制子的 pETDuet-T2DK-DKR 質(zhì)粒。上述技術(shù)方案中，pAC-ph Δ -AK3質(zhì)粒由PACYC184改造得到:pACYC184的2920位到3542位序列替換成#氨酰tRNA合成酶的序列，1425位到1524位序列替換成3個(gè)抑制性tRNA序列。pAC-ph Δ -AK3能編碼來(lái)源于/yrococcus horikoshii的賴氨酰tRNA合成酶和抑制型tRNA分子對(duì)，其中賴氨酰tRNA合成酶由谷氨酰胺tRNA合成酶啟動(dòng)子和終止子調(diào)控表達(dá)，抑制型tRNA由Ipp啟動(dòng)子和rrnC終止子調(diào)控表達(dá)；除此之外，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的112位天冬氨酸密碼子突變成為琥拍密碼子TAG以檢測(cè)/yrococcm horikoshii的賴氨酰tRNA合成酶和tRNA分子對(duì)的表達(dá)情況。具體地，pAC-ph Δ -AK3質(zhì)粒具有SEQ IDN0.1所述核苷酸序列。上述技術(shù)方案中，pETDuet-T2DK-DKR由質(zhì)粒pETDuet-1改造得到:在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)引入了雙羰基還原酶突變體的序列，106位到143位替換成了雙羰基還原酶突變體的序列，第二個(gè)多克隆位點(diǎn)引入了 #氨酰tRNA合成酶的序列，298位到354位序列替換成%ph氨酰tRNA合成酶的序列。pETDuet-T2DK-DKR的第一個(gè)多克隆位點(diǎn)連接有第二位帶琥珀突變的DKR基因；第二個(gè)多克隆位點(diǎn)連接有/yrococcM horikoshii的賴氨酰tRNA合成酶細(xì)tRNARS)的基因；兩段基因都由T7pix)m0ter啟動(dòng)并受乳糖操縱子調(diào)控表達(dá)。優(yōu)選地，所述pETDuet-T2DK-DKR質(zhì)粒包含以下四個(gè)特點(diǎn):(I)編碼的雙羰基還原酶的基因第二個(gè)密碼子由ACC突變成為琥珀密碼子TAG，(2)雙羰基還原酶突變基因的N端添加了His6的標(biāo)簽，(3)雙羰基還原酶的突變基因構(gòu)建到pETDuet-Ι的第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，并在T7promoter啟動(dòng)下由乳糖操縱子調(diào)控表達(dá)。(4) pETDuet-Ι的第二個(gè)多克隆位點(diǎn)添加/ tRNARS的基因來(lái)增強(qiáng)/A tRNARS的表達(dá)以提高賴氨酰tRNA合成酶分子對(duì)的抑制效率。具體地，pETDuet-T2DK-DKR質(zhì)粒具有SEQ ID N0.2所述核苷酸序列。pACYC184和pETDuet-Ι是商品化的載體，tRNA和tRNA合成酶的序列可參見(jiàn)公開(kāi)號(hào)為US 2006/0177900的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)，具體地，tRNA的序列請(qǐng)參見(jiàn)SEQ IDN0.3所示；tRNA合成酶的序列請(qǐng)參見(jiàn)SEQ ID N0.4所示。上述技術(shù)方案中，所述大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21 (DE3)。上述技術(shù)方案中，所述大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)由pAC-ph Δ -AK3質(zhì)粒和pETDuet-T2DK-DKR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞得到。本專利技術(shù)同時(shí)要求保護(hù)利用上述大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備含有D型賴氨酸的雙羰基還原酶突變體的方法，包括以下步驟:(I)在培養(yǎng)基中添加D型賴氨酸，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)上述大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，高壓破碎，離心取上清；(2)采用親和層析和陰離子交換層析結(jié)合的方法純化上清液得到含D型氨基酸的雙羰基還原酶。上述利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備含有D型賴氨酸的雙羰基還原酶突變體的方法具體包括以下步驟:(I)將pAC-phA-AK3 質(zhì)粒和 pETDuet-T2DK_DKR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞，平板涂布于含4μ g/ml四環(huán)素、40yg/ml的氨芐青霉素、20 μ g/ml的氯霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)18 20小時(shí)，挑取平板上單菌落于含四環(huán)素、氨芐青霉素、氯霉素的LB液體培養(yǎng)基37度培養(yǎng)約20小時(shí)；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于含四環(huán)素、氨芐青霉素、氯霉素的M9液體培養(yǎng)基使其最終OD約為0.1，然后37度培養(yǎng)30小時(shí)，轉(zhuǎn)接于含四環(huán)素、氨芐青霉素、氯霉素的M9液體培養(yǎng)基使其最終OD約為0.3，37度培養(yǎng)6小時(shí)(0D_=0.6)后加入D型賴氨酸和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，IOOmM) 37度誘導(dǎo)30小時(shí)后，離心收集菌體；(2)將離心收集的菌體和0.05M的PH8.0的磷酸鈉緩沖液按照質(zhì)量體積比為I: 5稀釋，高壓破碎，離心收集上清，利用親和層析和陰離子交換層析的方法進(jìn)行純化即本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉智志，楊欣，陳依軍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)藥科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：