一種產乳酸的重組藍藻及其制備方法與應用技術

本發明專利技術公開了一種產乳酸的重組藍藻及其制備方法與應用。本發明專利技術提供的方法，為代謝途徑改造并將D-乳酸脫氫酶編碼基因導入藍藻的基因組中，得到產光學純D-乳酸的重組藍藻；所述D-乳酸脫氫酶的氨基酸序列為序列表中的序列3。本發明專利技術的實驗證明，本發明專利技術通過代謝工程改造的方法，構建了重組藍藻，利用藍藻可以進行光合自養的特性，即可以利用太陽能將CO2直接轉化為有機物，可以在海水和污水中生長的特性及易于進行基因操作的優點，使重組藍藻可以利用太陽能和CO2直接合成光學純乳酸D-乳酸。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，尤其涉及一種產乳酸的重組藍藻及其制備方法與應用。
技術介紹
全球面臨的能源問題、環境問題向人們提出了發展可再生清潔能源化學品的要求，而糧食短缺要求可再生清潔能源化學品的發展要實現不與人爭糧、不與作物爭地、不與人和作物爭淡水。藍藻(blue-green algae)，又稱藍細菌(cyanobacteria)，是可以進行放氧光合作用的原核生物。藍藻廣泛分布在淡水、海水甚至是污水中，能夠利用CO2和太陽能快速繁殖， 是生物合成能源產品的理想宿主。作為原核生物，藍藻細胞結構簡單、遺傳背景與大腸桿菌相似，易于基因操作。近二十年來藍藻分子生物學的研究進展為對藍藻進行基因改造進而合成化工產品奠定了基礎，已有在藍藻中合成乙醇的成功案例。太陽能是地球上取之不盡的能源，而(X)2是導致地球變暖的溫室氣體，全球每年投入數以億計資金用于CO2減排。因此，通過對藍藻進行代謝途徑改造，使藍藻將太陽能和CO2直接轉化為能源化工產品，是實現可再生清潔能源持續、健康發展的理想途徑之一。乳酸(lactate)又稱2_羥基丙酸。因分子中有一個不對稱碳原子，而具有旋光性。 因此乳酸有L-乳酸和D-乳酸兩種旋光異構體。不同光學性質的乳酸用途不同。乳酸是生產聚乳酸的單體，而聚乳酸的性能與D-乳酸的含量相關，因此D-乳酸是生產優質聚乳酸所必須的。聚乳酸是理想的綠色高分子材料，可完全生物降解，具有良好的機械性能、物理特性、生物相容性及防腐、耐菌性等優點，是其它生物降解材料所無法比擬的。聚乳酸是傳統塑料制品的理想替代品，可應用于各行各業，如生產生物可降解塑料及人工合成生物組織等。全球每年對塑料的需求量是200億公斤，而聚乳酸的產量只有450萬公斤，由此可見全球對生產聚乳酸的原料乳酸的需求。由此可見生產光學純D-乳酸的重要性及必要性。乳酸的生產方法有發酵法、化學合成法和酶轉化法。發酵法主要是以糧食為原料， 由乳酸菌對糧食淀粉發酵生產乳酸；化學發和酶法是以能源化學品為原料且污染環境。這些方法主要用于生產L-乳酸或消旋乳酸LD-乳酸，而對光學純D-乳酸的生產是隨著聚乳酸的廣泛應用而興起的。為減緩能源短缺及避免污染環境，近年來科研人員嘗試通過代謝工程改造細菌用發酵法生產光學純乳酸，該方法雖然避免了加劇化石能源短缺的問題，但以糧食為原料，如大量生產將加劇全球糧食短缺問題，無法實現可再生能源的持續發展，因此利用太陽能直接將CO2轉化為有機物的光合自養細菌藍藻是生產光學純乳酸的理想途徑。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種構建重組藍藻的方法。本專利技術提供的方法，為將D-乳酸脫氫酶編碼基因導入藍藻的基因組中，得到產D-乳酸的重組藍藻；上述方法為通過代謝工程改造進行。所述D-乳酸脫氫酶的氨基酸序列為序列表中的序列3。在上述方法中，所述D-乳酸脫氫酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1 的自5’末端608-1788位核苷酸或序列表中序列2的自5’末端第605-1785位核苷酸。在上述方法中，所述重組藍藻為將雙鏈DNA通過同源重組導入藍藻的基因組；其中的雙鏈DNA為含有所述D-乳酸脫氫酶編碼基因的DNA ；而藍藻具體為淡水藍藻集胞藻6803或海水藍藻聚球藻7002 ；上述方法中的雙鏈DNA具體還包括上游同源臂、下游同源臂和篩選基因；其中的上游同源臂和下游同源臂具體為如下1)或2)1)所示的所述上游同源臂和下游同源臂為淡水藍藻集胞藻6803基因組中乙酰磷酸轉移酶基因的上游同源臂和下游同源臂；2)所示的所述上游同源臂和下游同源臂為海水藍藻聚球藻7002基因組中乳酸脫氫酶基因的上游同源臂和下游同源臂；其中的篩選基因具體為卡那霉素抗性基因；上述的雙鏈DNA具體為如下1)或2)1)所示的雙鏈DNA依次包括所述乙酰磷酸轉移酶基因的上游同源臂、D-乳酸脫氫酶編碼基因、篩選基因和所述乙酰磷酸轉移酶基因下游同源臂；2)所示的雙鏈DNA依次包括所述乳酸脫氫酶基因的上游同源臂、D-乳酸脫氫酶編碼基因、篩選基因和所述乳酸脫氫酶基因的下游同源臂。在上述方法中，1)所示的雙鏈DNA的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；2)所示的雙鏈DNA的核苷酸序列為序列表中的序列2。在上述1)所示的雙鏈DNA中，淡水藍藻集胞藻6803基因組中乙酰磷酸轉移酶基因的上下游同源臂分別為序列表中序列1的自5’末端第1-601位核苷酸(Upl)和5’末端第2727-3313位核苷酸(Downl)；卡那霉素抗性基因為序列表中序列1的自5’末端第 1795-2726位核苷酸(Km) ；D-Idh為序列表中序列1的自5，末端第608-1788位核苷酸；在上述幻所示的雙鏈DNA中，海水藍藻聚球藻7002基因組中乳酸脫氫酶基因的上下游同源臂分別為序列表中序列2的自5’末端第1-598位核苷酸(Up!3)和5’末端第2723-3278位核苷酸(Dowr^)；卡那霉素抗性基因為序列表中序列2的自5’末端第 1792-2723位核苷酸；D-Idh為序列表中序列1的自5’末端第605-1785位核苷酸。上述的方法具體可以為如下1)或2):1)所示的方法為將1)所示的雙鏈DNA通過同源重組導入淡水藍藻集胞藻6803基因組中，得到產D-乳酸的重組藍藻S. Ml ；2)所示的方法為將1)所示的雙鏈DNA通過同源重組導入海水藍藻聚球藻7002基因組中，得到產D-乳酸的重組藍藻S. M2。在上述方法中，1)所示的方法中，將1)所示的雙鏈DNA通過同源重組導入淡水藍藻集胞藻6803 基因組中為將重組質粒1導入淡水藍藻集胞藻6803 ；其中，該重組質粒1為將1)所示的雙鏈DNA插入pMD-18T中，得到表達所述D-乳酸脫氫酶的質粒；2)所示的方法中，將幻所示的雙鏈DNA通過同源重組導入海水藍藻聚球藻7002 基因組中為將重組質粒2導入海水藍藻聚球藻7002 ；其中，該重組質粒2為將2)所示的雙鏈DNA插入pMD_18T中，得到表達所述D-乳酸脫氫酶的質粒。由上述方法得到的重組藍藻也是本專利技術保護的范圍。本專利技術的第二個目的是提供一種重組質粒。本專利技術提供的重組質粒，為如下重組質粒1或重組質粒2 上述重組質粒1為將上述方法中所述的1)所示的雙鏈DNA插入pMD_18T中，得到表達所述D-乳酸脫氫酶的質粒；上述重組質粒2為將上述方法中所述的2)所示的雙鏈DNA插入pMD_18T中，得到表達所述D-乳酸脫氫酶的質粒。上述的重組藍藻或上述的重組質粒在制備D-乳酸中的應用也是本專利技術保護的范圍。本專利技術的第三個目的是提供一種制備D-乳酸的方法。本專利技術提供的方法，包括如下步驟先將上述的重組藍藻進行光照培養，再進行暗培養，收集培養產物，即得到D-乳酸；上述方法中，所述光照培養和暗培養的培養基均為以無機碳為唯一碳源的培養基；所述培養基具體為BG-Il培養基；該光照培養的溫度具體為_32°C，所述光照培養的光照強度為80μπι/ m2 · s-120ym/m2 · s，所述光照培養為振蕩培養，所述振蕩頻率為100r/min-150r/min，所述光照培養時間為5天-8天；上述方法中，該暗培養的溫度為-32°C，暗培養70小時-74小時；所述暗培養為靜置培養。本專利技術的實驗證明，本專利技術通過代謝工程改造的方法，構建了重組藍藻，利用藍藻可以進行光合自本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：周杰，張海峰，李寅，
申請(專利權)人：中國科學院微生物研究所，
類型：發明
國別省市：