本發(fā)明專利技術(shù)是一種鑒別小孢粉孢牛肝菌(T.microsporus)的特異引物及鑒別方法。特異引物TMf和TMr，其DNA序列為：TMf：GTCTTTCKCCATCCCAACCAACG；TMr：GAATCCAAACMACTCCAGCCCCG。通過牛肝菌樣品DNA提取、以該DNA為PCR擴(kuò)增的模板，用特異引物TMf和TMr進(jìn)行PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為1%的瓊脂糖凝膠上電泳，銹化乙錠染色，紫外透射儀檢測擴(kuò)增片段來進(jìn)行鑒別混合牛肝菌樣品中是否混有食毒不清的小孢粉孢牛肝菌。本發(fā)明專利技術(shù)的方法具有快速和高效的特點，一般從拿到牛肝菌混合樣品到鑒定出結(jié)果僅需2-3小時。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種小孢粉孢牛肝菌(7>70貝7狀fflicro^oi^s S. Z. Fu, Q. B. Wang & Y. J. Yao)的特異引物及其PCR鑒別方法，屬于利用分子生物學(xué)方法鑒別食毒不清牛肝菌
技術(shù)介紹
云南特殊的立體氣候、復(fù)雜的土壤結(jié)構(gòu)和豐富的植物物種及其多樣的植被類型，孕育了豐富的野生菌資源多樣性，其中牛肝菌又是種類最多的野生菌資源，這些資源在增加山區(qū)農(nóng)戶家庭收入中有重要的作用，有的偏遠(yuǎn)地區(qū)，野生菌的收入約占家庭年收入1/3-1/2。在野生菌資源中牛肝菌資源是分布最廣、種類最多、形態(tài)相似性較高、形態(tài)學(xué)鑒定相對較難、資源量最大的類群。牛肝菌類群真菌組織呈肉質(zhì)、易生蟲和腐爛，所以為了便于儲藏和攜帶，牛肝菌常常被加工成干片銷售，而牛肝菌經(jīng)加工成干片后形態(tài)變化大，導(dǎo)致品質(zhì)高的和品質(zhì)低的混淆，有毒種和可食種或食毒不清的種混淆，導(dǎo)致野生食用菌產(chǎn)品混淆嚴(yán)重，品質(zhì)層次不齊，給消費者人生安全帶來潛在危害。小孢粉孢牛肝菌(7 microsporus) 在云南分布區(qū)域廣、產(chǎn)量高、可食性不清晰，采集者和中間貿(mào)易商常常將其加工成干片混于其它可食或品質(zhì)較高的牛肝菌中銷售，偶有造成中毒事件發(fā)生。而目前鑒別小孢粉孢牛肝菌的方法主要是形態(tài)學(xué)分類法。要從混雜的商品牛肝菌中準(zhǔn)確鑒別出食毒不清的小孢粉孢牛肝菌需要有一定大型真菌分類學(xué)基礎(chǔ)，但消費者往往不具備這方面的知識，因此，一方面導(dǎo)致中毒事件的發(fā)生，另一方面，縱容了不法經(jīng)銷商。目前，國內(nèi)外對小孢粉孢牛肝菌的研究主要集中的形態(tài)分類及系統(tǒng)學(xué)研究方面，應(yīng)用其特異引物對該菌進(jìn)行快速鑒別或檢測的研究未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種小孢粉孢牛肝菌鑒別的PCR方法及其特異引物，能對混合牛肝菌樣品或小孢粉孢牛肝菌進(jìn)行快速鑒別。每一個物種都有其獨有的遺傳物質(zhì)DNA，它不會隨環(huán)境及表型變化而變化。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，在細(xì)胞外進(jìn)行物種特有DNA片段或序列操作成為了現(xiàn)實，即運(yùn)用物種的特異引物，通過PCR擴(kuò)增，并應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測其特有片段，實現(xiàn)物種的快速鑒別成為現(xiàn)實。本專利技術(shù)設(shè)計了鑒別小孢粉孢牛肝菌的特異引物TMf和TMr，其DNA序列為 TMf=GTC TTT CKC CAT CCC AAC CAA CGTMr :GAA TCC AAA CMA CTC CAG CCC CG用上述特異引物鑒別小孢粉孢牛肝菌的方法按以下步驟進(jìn)行1)牛肝菌樣品DNA提取；2)以上述DNA為模板，用特異引物TMf和TMr進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件94°C變性 5 min，然后進(jìn)入連續(xù)35個循環(huán)(94°C變性0. 5 min，58. 2°C退火0. 5 min，72°C延伸2 min), 循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸5 min；3)取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠上電泳，銹化乙錠染色，紫外透射儀檢測擴(kuò)增片段有無及大小，鑒別牛肝菌樣品中是否混有食毒不清的小孢粉孢牛肝菌。本專利技術(shù)的方法采用一對特異引物，通過PCR反應(yīng)即能有效地鑒別混合牛肝菌中是否混有小孢粉孢牛肝菌。具有快速和高效的特點，一般從拿到牛肝菌混合樣品到鑒定出結(jié)果僅需2-3小時。這對打擊摻假的不法商販，從源頭上凈化牛肝菌市場，有效保護(hù)消費者的食用安全具有重要的實際意義。附圖說明圖1為牛肝菌混合樣品中小孢粉孢牛肝菌特異引物擴(kuò)增的DNA片段瓊脂糖凝膠電泳圖，電泳圖說明見表1。表 1—序號 |a Ib Ic樣品|Mark I表2|表3(表2與表3混合牛肝菌樣品物種目錄的區(qū)別在于表2中有L123 Tylopilus ndcivspoi~us，a 3中沒有，Mark的分子量為2)。具體實施例方式實施例1、混合牛肝菌樣品采集目錄，見表2和表3。表2混合牛肝菌樣品物種目錄1_權(quán)利要求1.一種鑒別小孢粉孢牛肝菌鑒的特異引物，其特征在于特異引物TMf和TMr，其DNA序列為TMf=GTC TTT CKC CAT CCC AAC CAA CGTMr :GAA TCC AAA CMA CTC CAG CCC CG 。2.一種用權(quán)利要求1所述的特異引物鑒別小孢粉孢牛肝菌的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)牛肝菌樣品DNA提取；(2)以上述DNA為PCR擴(kuò)增的模板，用特異引物TMf和TMr進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)取上述(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠上電泳，銹化乙錠染色，紫外透射儀檢測擴(kuò)增片段有無及大小。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異引物鑒別小孢粉孢牛肝菌的方法，其特征在于所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增條件是94°C變性5 min，然后進(jìn)入連續(xù)35個循環(huán)，每個循環(huán)為94°C變性.0.5 min，58. 2°C退火 0. 5 min，72°C延伸 2 min，循環(huán)結(jié)束后于 72°C延伸 5 min。全文摘要本專利技術(shù)是一種鑒別小孢粉孢牛肝菌(T.microsporus)的特異引物及鑒別方法。特異引物TMf和TMr，其DNA序列為TMfGTCTTTCKCCATCCCAACCAACG；TMrGAATCCAAACMACTCCAGCCCCG。通過牛肝菌樣品DNA提取、以該DNA為PCR擴(kuò)增的模板，用特異引物TMf和TMr進(jìn)行PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為1%的瓊脂糖凝膠上電泳，銹化乙錠染色，紫外透射儀檢測擴(kuò)增片段來進(jìn)行鑒別混合牛肝菌樣品中是否混有食毒不清的小孢粉孢牛肝菌。本專利技術(shù)的方法具有快速和高效的特點，一般從拿到牛肝菌混合樣品到鑒定出結(jié)果僅需2-3小時。文檔編號C12R1/645GK102559906SQ20121002410公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月3日專利技術(shù)者張小雷, 李樹紅, 柴紅梅, 蘇開美, 趙永昌, 趙靜 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李樹紅，柴紅梅，趙永昌，張小雷，蘇開美，趙靜，
申請(專利權(quán))人：云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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