本發明專利技術公開了一種人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法。它是取人臍帶用膠原酶II消化，直至Wharton膠全部消化，然后收集消化下來的單細胞，將單細胞接入α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化；將胰蛋白酶消化的細胞懸液傳代接種于α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化，再傳代接種于α-MEM培養基中懸浮培養，如此重復進行傳代培養，本步驟中的傳代培養的α-MEM培養基中的胎牛血清的濃度是隨傳代次數的增加而遞減直至無胎牛血清。該方法的取材-人臍帶來源廣泛、制備人臍帶間充質干細胞快速、安全，不受倫理限制，后續培養不依賴胎牛血清的特征使得培養成本和臨床使用風險大幅降低，具有很好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥領域，具體涉及ー種人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法。
技術介紹
近幾年來，干細胞的研究取得了重大突破。1999和2000年，世界最權威的美國 ((Science))雜志連續2年將干細胞和人類基因組計劃列為當年的10大科學突破，尤其是在 1999年甚至將干細胞研究列為第一位。干細胞很可能在醫學領域引發革命性進步，因而具有不可估量的醫學價值而引起全世界的廣泛關注和研究，美國《時代》周刊認為干細胞和人類基因組計劃將同時成為新世紀最具有發展和應用前景的領域。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，簡稱MSCs)是來源于成熟組織中的多能干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，是細胞移植和組織工程的新型種子細胞， 具有廣闊的應用前景。其中，研究最為廣泛的MSCs是來源于骨髓的間充質干細胞，盡管其倫理問題與胚胎干細胞相比大為減少，但骨髓細胞必須通過浸入的途徑獲得，及其隨著年齡的增長，干細胞數量顯著減少。許多研究機構已經在其它組織中尋找到多能干細胞，包括動員的外周血、臍血、乳牙、臍帶間充質細胞，然而，從這些組織中得到的細胞數量十分有限。目前添加了胎牛血清的培養基被認為是體外擴增間充質干細胞最有效的培養基， 然而，血清成分不明確，其中可能含有動物攜帶的已知的或未知的病原體，在臨床應用中具有潛在的危險，并且胎牛血清價格昂貴。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供ー種人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法， 該方法的取材一人臍帶來源廣泛、制備人臍帶間充質干細胞快速、安全，不受倫理限制等優越性，后續培養不依賴胎牛血清的特征使得培養成本和臨床使用風險大幅降低，具有很好的應用前景。本專利技術的人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法，其特征在干，包括以下步驟(a)取人臍帶用膠原酶II消化，直至Wharton膠全部消化，然后收集消化下來的單細胞，將單細胞接入α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80% 90%融合吋，用胰蛋白酶消化；(b)將胰蛋白酶消化的細胞懸液傳代接種于α -MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80% 90%融合吋，用胰蛋白酶消化，再傳代接種于α -MEM培養基中懸浮培養，如此重復進行傳代培養，本步驟中的傳代培養的α-MEM培養基中的胎牛血清的濃度隨傳代次數的増加而遞減直至無胎牛血清。所述的步驟(b)優選為將胰蛋白酶消化的細胞懸液傳代接種于胎牛血清體積分數為8 %的α -MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80 % 90 %融合吋，用胰蛋白酶消化，再傳代接種于胎牛血清體積分數為5%的的α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到 80% 90%融合吋，用胰蛋白酶消化，再傳代接種于胎牛血清體積分數為2%的α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80% 90%融合吋，用胰蛋白酶消化，再傳代接種于無胎牛血清的α -MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80% 90%融合吋，用胰蛋白酶消化， 然后一直用無胎牛血清的α-MEM培養基進行傳代培養。一般α -MEM培養基中，其胎牛血清的體積分數為10%。因此配制胎牛血清體積分數為8%的α-MEM培養基，其配制方法是將含胎牛血清的α-MEM培養基和無胎牛血清的 α -MEM培養基按照4 1的體積比混合。所述的胎牛血清體積分數為5%的α -MEM培養基，其配制方法是將含胎牛血清的α-MEM培養基和無胎牛血清的α-MEM培養基按照1 1 的體積比混合。所述的胎牛血清體積分數為2%的α-MEM培養基，其配制方法是將含胎牛血清的α-MEM培養基和無胎牛血清的α-MEM培養基按照1 4的體積比混合。所述的步驟(a)中的膠原酶II的濃度優選為lg/L。所述的步驟(b)中的胰蛋白酶消化的細胞懸液，其密度優選為2X105 IXlO6個 /ml。所述的步驟(b)中傳代接種的接種比例優選為1 2 3，懸浮培養的條件優選都為37°C、飽和濕度95%、體積分數為5%的CO2的培養箱中培養，每3 4天全量換培養基一次。利用本專利技術的人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法制備得到的人臍帶間充質干細胞帶型正常，具有向成骨細胞分化的潛能，具有廣闊的應用前景。本專利技術的人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法，其取材為人臍帯，來源廣泛，應用其制備人臍帶間充質干細胞快速，從15cm左右的臍帶中分離培養出hUCMSCs，在體外培養三周左右，可獲得(5 10) X IO9個細胞，并且安全，不受倫理限制等優越性，后續培養不依賴胎牛血清使得培養成本和臨床使用風險大幅降低，具有很好的應用前景。附圖說明圖1是實施例1的P6代hUCMSCs的形態圖；圖2是實施例1的P6代hUCMSCs表面標記流式細胞儀檢測圖譜；圖3是實施例1的P6代hUCMSCs染色體核型圖譜；圖4是實施例1的P6代hUCMSCs經成骨誘導培養基誘導培養3周后的細胞染色圖，其中圖4A是堿性磷酸酶染色圖，圖4B是茜素紅染色圖。具體實施例方式以下實施例是對本專利技術的進ー步說明，而不是對本專利技術的限制。實施例1 1、人臍帶間充質細胞的分離在無菌條件下取足月產健康男嬰兒臍帶組織，經醫院倫理委員會批準。浸泡于 α -MEM培養基中，超凈臺內取出臍帶，D-Hank’ s平衡液充分洗滌殘留的血液，去除臍靜脈、 臍動脈及臍帶外膜，剝離Wharon膠，并將其剪碎至ImmX ImmX Imm大小組織塊。將組織塊移至1. Og/L膠原酶II中(按IOml的酶溶液消化3克的組織塊計)，加入^iil α -MEM培養基，在37°C恒溫振蕩儀內消化，直至Wharon膠全部消化，然后用不銹鋼濾網將消化下來的細胞制成單細胞懸液，將細胞懸液轉入無菌離心管，以20倍細胞懸液的體積的α -MEM培養基反復吹打稀釋，2500r/m離心30分鐘，PBS洗2遍，用臺盤蘭染色，計數活細胞，以2X IO5 個/ml的密度將所得細胞接種于含有75ml α -MEM培養基的普通培養瓶中，在37°C、飽和濕度95%，體積分數為5% CO2培養箱內培養。第3天全量換培養基，棄去未貼壁細胞，以后根據細胞生長情況每2 3天換培養基。倒置相差顯微鏡下觀察，細胞達80%融合后，用質量分數為1. 25g/L胰蛋白酶消化，調整細胞密度為2X IO5 1 X IO6個/ml，而得到含人臍帶間充質干細胞的細胞懸液。2、人臍帶間充質干細胞的無血清培養、純化及擴增胎牛血清的體積分數為8%的α-MEM培養基，其配制方法是將含胎牛血清(體積分數為10%)的α-MEM培養基和無胎牛血清的α-MEM培養基按照4 1的體積比混合。胎牛血清的體積分數為5%的α-MEM培養基，其配制方法是將含胎牛血清(體積分數為10% )的α-MEM培養基和無胎牛血清的α-MEM培養基按照1 1的體積比混合。胎牛血清的體積分數為2%的α-MEM培養基，其配制方法是將含胎牛血清(體積分數為10%)的α-MEM培養基和無胎牛血清的α-MEM培養基按照1 4的體積比混合。無胎牛血清的α -MEM培養基是指α -MEM培養基中不含有胎牛血清。將上ー步驟所得的細胞密度為2Χ105 IXlO6個/ml的含人臍帶間充質干細胞的細胞懸液按照1 2的比例接種于含有75ml胎牛血清的體積分數本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李力，肖揚，
申請(專利權)人：肖揚，
類型：發明
國別省市：
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