本發明專利技術公開了一種檢測苯乙醇胺A的直接競爭法酶聯免疫檢測試劑盒。本發明專利技術所提供的苯乙醇胺A的酶聯免疫試劑盒包括苯乙醇胺A特異性抗體包被的酶標板、苯乙醇胺A辣根過氧化物酶標記物。本發明專利技術的檢測苯乙醇胺A的酶聯免疫試劑盒靈敏、快速、準確，主要用于大批樣品的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準確性等特點，可快速檢測飼料及畜產品中殘留的苯乙醇胺A。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及酶聯免疫和獸藥殘留檢測領域。具體而言，本專利技術涉及一種用于檢測苯乙醇胺A的酶聯免疫試劑盒。技術背景苯乙醇胺A又稱為克侖巴胺(clenrapmine CLRA),學名為2_4-(4_硝基苯基)丁基-2-基氨基-I-甲氧基苯乙醇，是一種人工合成的化學物質。克侖巴胺是福莫特羅的同分異構體，是美國禮來公司合成萊克多巴胺的副產物，具有同瘦肉精和萊克多巴胺相同的作用和效果，屬于￠2-激動劑的一種。被農業部第1519號公告列為禁止在飼料和動物飲水中使用的物質。因此必須建立檢測方法，禁止此類事件的發生，保障食品安全。現有的苯乙醇胺A檢測方法多為色譜法，但是這些方法的靈敏度受樣品的凈化、 濃縮等步驟的影響較大；再者這些方法需要復雜的儀器，且過程繁瑣，不適應現場大量樣本的篩查。基于抗原抗體免疫反應的免疫學檢測技術為苯乙醇胺A殘留物的分析檢測提供了篩查方法。該技術研究的關鍵是半抗原分子的設計、合成和人工全抗原及抗體的制備。因為苯乙醇胺A是小分子化合物，本身沒有免疫原性，必須將其與大分子載體蛋白偶聯得到具有免疫原性的人工抗原。目前苯乙醇胺A的ELISA方法尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種快速檢測苯乙醇胺A的酶聯免疫試劑盒。本專利技術提供了一種快速檢測苯乙醇胺A的直接競爭法酶聯免疫試劑盒，該試劑盒包括包被有苯乙醇胺A特異性抗體的酶標板、苯乙醇胺A-辣根過氧化物酶標記物。其中苯乙醇胺A特異性抗體為兔抗苯乙醇胺A的多克隆抗體，可用苯乙醇胺A與載體蛋白偶聯物作為免疫原通過免疫動物(例如兔、羊、鼠等)制得。所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、 人血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。所述的苯乙醇胺A-辣根過氧化物酶標記物采用化學方法將苯乙醇胺A與辣根過氧化物酶偶聯得到。用于制備所述酶標板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應板凹孔。為方便現場檢測和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進一步包括苯乙醇胺A-辣根過氧化物工作液、苯乙醇胺A標準溶液、顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。所述的洗滌液為0. 05% -0. 5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑 A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為I : I)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺。所述的濃縮樣品稀釋液為含0. 1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。另一方面，本專利技術還提供了一種檢飼料測樣品中苯乙醇胺A含量的方法，包括步驟(I)樣品前處理；(2)用權利要求1-7任一所述的試劑盒進行檢測，向包被有苯乙醇胺A抗體的酶標板孔中加入標準品或樣品溶液，再加入苯乙醇胺A-辣根過氧化物工作液，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑，孵育后終止，用酶標儀測定吸光度值；(3)分析檢測結果。本專利技術試劑盒的檢測原理為將苯乙醇胺A抗體吸附于固相載體上，加入樣本或苯乙醇胺A標準品溶液并加入苯乙醇胺A-辣根過氧化物工作液，待測樣品中苯乙醇胺A和苯乙醇胺A-辣根過氧化物競爭酶標板上的苯乙醇胺A抗體，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中苯乙醇胺 A的量呈負相關，與標準曲線比較即可得出苯乙醇胺A濃度范圍。有益效果本專利技術檢測苯乙醇胺A的試劑盒主要采用直接競爭酶聯免疫測定法，定性或定量測定樣品中苯乙醇胺A含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品。本專利技術該試劑盒采用高特異性的苯乙醇胺A多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節省時間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差， 本專利技術具有靈敏度高、特異性強、高精確度、高準確度、對儀器設備要求低、試劑保存時間長、自動化程度高、無放射性同位素污染的等優點，可在飼料及動物源性產品檢測中發揮重要作用。附圖說明附圖為苯乙醇胺A抑制曲線。具體實施方案提供下述實施例是為了更好地進一步理解本專利技術，而決不對本專利技術的內容和保護范圍構成任何限制。實施例I免疫原的合成及免疫血清的制備I. I試劑與儀器苯乙醇胺A (杭州迪恩科技有限公司惠贈)，琥珀酸酐(購自北京耀北生物技術有限公司)，吡啶(Pyridine，AR. WM = 79. 10，含量> 99. 5%，天津市科密歐化學試劑開發中心)，N，N- 二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF，美國新澤西州ACR0S0RGANICS公司生產，購自百靈威化學試劑公司)，EDC(購自百靈威化學試劑公司)，牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等(購自北京耀北生物技術有限公司)，其它試劑均為分析純。雙光束紫外可見分光光度儀(TU-1909，北京普析通用儀器有限公司)，層析裝置 (3057型便攜式記錄儀，重慶川儀四廠；SBS系列數控計滴器，恒流泵，自動部分收集器，層析柱，上海滬西分析儀器廠)，磁力攪拌器(上海東榮豐科學儀器有限公司)，臺式離心機 (Minispin 最大轉速 13400rpm 最大離心力 12100rcf, 2ml X 12)，1.2苯乙醇胺A人工抗原的合成稱取苯乙醇胺A 3. 4mg (0. Olmmol)溶于0. 4ml卩比唳溶液中，加入琥拍酸酐4mg室溫攪拌反應過夜。吹干吡啶，用0. 2mlDMF溶解酸酐活化的苯乙醇胺A，活化的苯乙醇胺A溶液逐滴加入到0. IM pH 7. 5冰冷載體蛋白(BSA、OVA或KLH)PBS溶液中，加入EDC 20mg，攪拌反應過夜。將偶聯物過S印hadexG_25M凝膠層析純化，用0. OlM pH 7. 4PBS三倍柱床體積平衡，調節流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提純偶聯物，洗脫液用 pH 7. 4 0. OlM PBS0I. 3苯乙醇胺A辣根過氧化物酶標記物的合成稱取苯乙醇胺A 3. 4mg (0. Olmmol)溶于0. 4ml卩比唳溶液中，加入琥拍酸酐4mg室溫攪拌反應過夜。吹干吡啶，用0. 2mlDMF溶解酸酐活化的苯乙醇胺A，活化的苯乙醇胺A溶液逐滴加入到0. IM pH 7. 5辣根過氧化物酶(HRP)PBS溶液中，加入EDC 20mg，攪拌反應過夜。將偶聯物過S印hadexG_25M凝膠層析純化，用0. OlM pH 7. 4PBS三倍柱床體積平衡，調節流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提純偶聯物，洗脫液用 pH 7. 4 0. OlM PBS0I. 4免疫及特異性抗體的制備將上述苯乙醇胺A-BSA偶聯物用生理鹽水稀釋成lmg/ml溶液備用。選取6只體重2 2. 5Kg健康雄性新西蘭大白兔。將偶聯物與等量弗氏完全佐劑通過注射器對抽法混合成油包水的乳濁液,按lmg/Kg體重的量進行首次免疫，采取背部皮下多點注射。每隔兩周加強免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后10天，耳緣靜脈取血1ml，進行抗體效價檢測，當抗體效價不再升高時，不加佐劑進行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后頸動脈放血，室溫凝固2h后4°C過夜，8000r/min離心10分鐘，除去血塊,血清部分用50%飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33%飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：于洪俠，
申請(專利權)人：于洪俠，
類型：發明
國別省市：
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