用于直接化學裂解的方法和組合物技術

直接化學裂解組合物包括檢驗相容性緩沖劑成分和檢驗相容性表面活性劑。當與樣品儲存組合物組合時，此類組合物防止對于從生物樣品中的細胞裂解而來的核酸和蛋白的不想要的修飾。來自此類組合物的樣品的檢驗無需昂貴的和耗時的步驟，例如離心和延長的高溫處理。本發明專利技術的直接化學裂解組合物允許從生物樣品中的細胞直接進行核酸提取，無需倒掉轉運培養基或更換轉運培養基為檢驗相容性緩沖劑。無需將樣品與蛋白酶K或其它酶組合以從細胞中提取核酸。還涉及用于裂解細胞以獲得用于檢驗的靶核酸的方法，以及用于組合直接化學裂解組合物和樣品的試劑盒。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于直接化學裂解的方法和組合物相關申請的交叉引用本申請要求2009年9月3日提交的美國臨時專利申請號61/239，553的申請日的權益，其公開內容在此通過引用方式并入本文。
技術介紹
本專利技術總體上涉及在保存的生物樣品上進行診斷測試的方法和組合物，尤其涉及在此類保存的樣品上進行核酸提取和擴增的方法。在醫學診斷和醫學研究的領域，會從患者或受試者(例如，人類患者、人類受試者、人類疾病的實驗動物模型)獲取樣品(例如，組織)以測定該受試者的狀況以支持研究，確定該患者的當前狀況以進行醫學診斷，確定該患者對目前的治療或處理進程的應答，寸寸。為了分析而獲取的樣品，無論是為了進行醫學診斷抑或用于科學研究，通常被置于特殊的轉運/保存介質中以防止從受試者中取出時樣品降解或分解。因此，樣品將盡可能地接近其從受試者中被取出時所處的狀況。這確保了該樣品精確地反映在取樣時患者或受試者的狀態，并因此將會在任何隨后的樣品研究中產生最準確的結果。這些研究中的一些研究將包括核酸(例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))提取和擴增。從生物樣品中提取DNA和/或RNA尤其需要細胞壁的裂解(在原核細胞的情況下)、細胞膜的裂解(在某些真核細胞的情況下)或病毒衣殼的裂解(在病毒的情況下)。 部分地，隨后的擴增需要引物與靶核酸內的特定位點的結合。有多種程序可用于核酸的提取和隨后的擴增。這些程序中的一些程序利用高通量設備。高通量設備是自動化的，意指樣品與合適的化學品一起被置于設備內，進行提取和擴增步驟、無需操作者進一步進料(例如，Viper XTR系統，見Becton Dickinson BD ProbeTec Qx Amplified DNA Assay Package Insert, Becton Dickinson 2008)。其它的程序利用復雜度沒這么高的設備，通常被稱作人工程序。然而，不論何種程序，總是需要裂解細胞或病毒衣殼以釋放核酸，需要使核酸附著至顆粒、例如氧化鐵，以便從樣品的其余部分提取核酸，需要使引物與靶核酸結合以擴增核酸。轉運介質(例如，液體細胞培養基)通常包含以一種或多種方式保存某些細胞的一種或多種成分(例如，防止細胞壁分解或細胞膜被細胞裂解)。另外，這些成分中的一些具有保存樣品和去污染的雙重目的。已知的是，這些成分會干擾裂解細胞膜和細胞壁的能力，干擾提取的核酸與核酸提取中所使用的顆粒附著的能力，以及干擾擴增靶核酸的能力。基于液體的細胞學組合物例如SurePath (Tripath Imaging, Inc.，N. C.)溶液或ThinPrep PreservCyt 溶液Otologic inc.，ΜΑ)會對從暴露于其中的樣品提取可擴增的靶核酸的能力產生不利影響。已經提出了很多理由來解釋所觀察到的這種不利影響，包括1)核酸被介質中的成分降解；幻介質中的成分使核酸發生化學變化；和3)組織中細胞裂解機制的抑制，其抑制用于提取和擴增的核酸的釋放。為了避免液體細胞學組合物對提取的DNA造成的不利影響，在裂解之前從組合物中將細胞提取出來。通常而言，提取需要離心以輕輕倒出液體細胞學組合物，與細胞分離。然后，將細胞重懸于緩沖劑中并以酶裂解之。這樣的額外步驟通常與很多高通量設備、例如上述的Viper 系統是不相容的。 即使是在不涉及自動化的情況下，此類步驟也是耗時的。這些步驟所需的額外時間會使測試結果的獲得被延后，最好能避免之。用于純化核酸的介質試劑盒的一個實例是來自Qiagen的QIAamp MinElute Media Kit。該介質試劑盒描述于日期為2004年2月的QIAmp MinElute Media Handbook中。所描述的QIAamp程序具有4個步驟裂解、結合、洗滌和洗脫。在該程序中，使用蛋白酶K將樣品裂解，然后使核酸通過吸附至硅膠溶解產物而與QIAmp MinElute柱結合。雖然QIAamp 程序是經證明可行的方法，但是其僅僅對于250 μ 1的液體細胞培養基的純化是優化的，并且既費力又耗時(即其需要18個步驟，包括65分鐘的不同溫度的溫育，5次離心步驟，2次真空過濾步驟和數個混合步驟)。迄今仍然需要使用此類多步驟方法以成功地從固定樣品、 例如液體細胞培養基和石蠟包埋的組織中純化核酸。眾所周知的是，從固定的介質中純化核酸比從新鮮組織中更困難，因為介質中的固定劑會向樣品中的靶分子引入不想要的化學修飾。這些反應的發生會使樣品中的核酸交聯或修飾樣品中的核酸。轉運介質中的其它添加物也會引起不想要的交聯。例如，由于轉運介質中福爾馬林的存在而引起的交聯，其描述于 Rai，V.K.等人"Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic ribonuclease A I-Structural and functional alterations, “ Lab. Invest. Vol. 84(3) :292-299 (March 2004)。甲醛還會在核酸與蛋白之間產生交聯，其描述于 Solomon，M. J.，“ Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking :A probe for in vivo chromatin structures，“ Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 82,pp. 6470-6474(1983 年 10 月)。如 Sepp, R.等人〃 Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR,“ J. Clin. Pathol. Vol. 47 :318-323 (1994) 中所描述，從福爾馬林固定的石蠟中獲取的細胞中提取DNA通常需要加工步驟(例如，延長的煮沸)，這會對用于擴增的DNA的量造成不利影響。根據Sepp，R.等人，需要煮沸樣品， 這尤其是為了使蛋白酶K失活。此外，蛋白酶K被很多固定劑中的成分抑制，這直接利用了其在分解蛋白交聯方面的有限的有效性。因此，仍然需要用于從組織和其它細胞及細胞成分中提取DNA的、克服了對核酸造成的交聯和其它不想要的修飾的問題、但無需延長的高溫處理(這會對樣品造成不利影響或使過程更加費錢、耗時)的方法和組合物。
技術實現思路
用于與樣品儲存組合物組合的直接化學裂解組合物，其包括檢驗相容性緩沖劑成分和檢驗相容性表面活性劑。此類組合物防止了從生物樣品中的細胞裂解而來的核酸的不想要的修飾，從此類組合物進行的樣品檢驗無需昂貴且耗時的步驟、例如離心和延長的高溫處理。本專利技術的直接化學裂解組合物允許從生物樣品中的細胞直接提取核酸，無需倒掉細胞培養基或更換細胞培養基為檢驗相容性緩沖劑?？梢栽跇悠啡匀慌c直接化學裂解組合物組合時，直接發生細胞裂解。無需將樣品與蛋白酶K或一些其它酶組合以從細胞中提取核酸。在一個實施方式中，直接化學裂解組合物用作用于樣品稀釋、儲存、運輸等的基于液體的細胞學(LBC)組合物的添加物。直接化學裂解組合物允許在從樣品進行核酸提取之前，在樣品被預溫或溫育時進行樣品裂本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：F·楊，SS·王，L·M·沃恩，M·波特，E·羅斯，
申請(專利權)人：貝克頓·迪金森公司，
類型：發明
國別省市：