本發明專利技術公開了一種CoxBIgG/IgM酶聯免疫法檢測試劑盒，包括多孔酶聯板，分別裝有樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、IgG酶標抗體、底物A、底物B、濃縮洗滌液和終止液的試劑瓶各一瓶，所述多孔酶聯板的微反應孔的內壁包被有CoxB組抗原。本發明專利技術的CoxBIgG/IgM酶聯免疫法檢測試劑盒特異性與靈敏度高，操作時間短，可用于多人份定性檢測CoxBIgG/IgM。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及CoxB IgG/IgM酶聯免疫法檢測試劑盒。
技術介紹
柯薩奇B組(CoxB)病毒是腸道病毒的一種，柯薩奇B病毒感染后，可出現無菌性腦膜炎、肌麻庳、皰疹性咽峽炎、心肌炎和心包炎、急性出血性結膜炎等。柯薩奇B組有6個血清型。CoxB IgG/IgM的測定能夠及早檢測出患者是否新近遭受CoxB病毒感染，特別對急性期的心肌炎進行CoxB IgG/IgM的普查，將對心肌疾病提供診斷依據，特別是CoxB IgM的陽性，將提示患者有可能心肌早期受到感染，同時可配合臨床診斷和觀察的有利指標，對患者的治療和康復有著重要的意義。目前柯薩奇B組病毒感染的診斷方法主要有三種，病毒分離鑒定、血清學檢查及分子生物學技術。病毒分離培養和分子生物學法繁復費事，傳統的病毒分離法耗時長，而 PCR方法存在檢測成本昂貴且對環境交叉污染的風險高，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需求，快速.準確。血清學的進展(快速法)開拓了該病毒的快速診斷技術，其具有高靈敏度及高特異性的優勢，在病毒感染的診斷中發揮了越來越重要的作用。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術中的缺陷，提供一種CoxB IgG/IgM酶聯免疫法檢測試劑盒。本專利技術采用了下述技術方案來解決上述技術問題一種CoxB IgG/IgM酶聯免疫法檢測試劑盒，包括多孔酶聯板，分別裝有樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、IgG酶標抗體或IgM酶標抗體、底物A、底物B、濃縮洗滌液和終止液的試劑瓶，所述多孔酶聯板的微反應孔的內壁包被有CoxB組抗原。CoxB IgG/IgM酶聯免疫法檢測試劑盒即為CoxB IgG或CoxB IgM酶聯免疫法檢測試劑盒。進一步的，所述多孔酶聯板為48孔酶聯板或96孔酶聯板。試劑盒中的樣品稀釋液也可采用常規的ELISA樣品稀釋液，如含有磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液，或者也可以為含有O. OlM磷酸緩沖液(PBS, ρΗ7· 2-7. 5)和< O. Iwt% NaN3 的IOwt %小牛血清。試劑盒中的陽性對照為經病毒滅活的含有CoxB組IgG抗體或CoxB組IgM抗體的陽性血清。試劑盒中的陰性對照為陰性血清。試劑盒中的IgG酶標抗體為辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG抗體，IgG抗體可以是各種類型的IgG抗體，如鼠抗人IgG、羊抗人IgG或兔抗人IgG。試劑盒中的IgM酶標抗體為辣根過氧化酶(HRP)標記的μ鏈IgM抗體，.試劑盒中的底物Α、底物B均為常規ELISA底物A和底物B。試劑盒中的濃縮洗滌液可采用常規的濃縮的ELISA洗滌液，如含有吐溫的磷酸鹽緩沖液，或者也可以為20X濃縮的O. 01MPBS。試劑盒中的終止液可采用常規的ELISA終止液。多孔酶聯板上包被的CoxB組抗原的主要成分為純化并完全滅活的Cox BI、Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5和Cox B6病毒的混合。各病毒混合比例可根據檢測需要任意調整。一般情況下，以病毒總量為基礎計，各病毒的重量百分比均為6-20%。多孔酶聯板上包被抗原的方法采用常規。進一步的，所述CoxB組抗原采用包括下列步驟的方法制備獲得I)病毒擴增將選自 Cox BI、Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5 和 Cox B6 病毒中之任一的毒種接種至單層的Hela細胞中培養獲得細胞病毒液；2)病毒釋放將細胞病毒液重復凍融三次以上，而后在冰水浴中超聲波破碎細胞；3)病毒滅活將重復凍融三次以上的細胞病毒液或經超聲波破碎細胞的細胞病毒液完全滅活，滅活的細胞病毒液經病毒滅活試驗檢驗需呈陰性；4)病毒抗原純化4. I將經病毒釋放與病毒滅活的細胞病毒液置于18-20°C融解適當時間后，加入甲醛水溶液混合均勻，甲醛在混合液中的終濃度為O. 12-0. 20v% ；4. 2混合液梯度離心分離病毒4. 3分離出的病毒加入保護液獲得病毒抗原液。5)利用步驟 1-4 分別制備 Cox BI、Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5 和 Cox B6 的病毒抗原液，將制得的Cox BUCox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5和Cox B6的病毒抗原液混合獲得CoxB組抗原。步驟I中，Hela細胞接種CoxB組的病毒毒種后可采用常規適于Hela細胞生長的條件培養。較優的，可如實施例所列舉的，先置37°C吸附I小時，加入細胞維持液(含2wt% 小牛血清的1640培養液)后，置5% CO2孵箱36°C培養至100%細胞發生病變。步驟2中，冰水浴溫度一般為O V。步驟3中，細胞病毒液完全滅活可采用常規完全滅活病毒的方法，如紫外線滅活。步驟4中，步驟4. I所述甲醛水溶液可為福爾馬林。步驟4. I中，融解時間為15_20min。步驟4. 2中，梯度離心分離病毒具體包括下列步驟4. 2. I混合液低速離心至少20分鐘，取上清；4. 2. 2上清35000-45000rpm/min離心至少60分鐘，取沉淀；4. 2. 3沉淀用PBS(磷酸鹽緩沖液)溶解后，置于13_17wt %甘油水溶液之上， 50000-65000rpm/min離心60分鐘以上，取沉淀，沉淀即為分離出的病毒。進一步的,步驟4. 2. I中，低速離心的離心速度為5000-8000rpm/min。步驟4. 2. 3中所用PBS為O. 01-0. 05M, pH7. 2-7. 5。沉淀與PBS的體積比為 I (2-3)。步驟4.3中所述保護液可為甘油或二甲亞砜，病毒與保護液的體積比可為 I (1-2)。進一步的,所述CoxB組抗原的制備還包括步驟5 :將利用步驟 1-4 分別制備的 Cox BI、Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5 和 Cox B6的抗原液中的多種混合。上述純化病毒的方法在病毒離心濃縮前采用適當的方法處理細胞病毒液，尤其是適當濃度甲醛溶液的處理，一方面在蛋白質末端基團之間形成交聯鏈(橋鍵)，減慢了蛋白的降解速度，不讓細胞中的病毒顆粒被其他有機溶劑迅速降解破壞，從而起到有效固定、穩定、保護蛋白劑的作用，另一方面，適當濃度的甲醛溶液處理還提高了病毒離心濃縮前的去渣力，再配合適當的濃縮離心方法，最終有效提高了病毒純化回收率，增強了病毒抗原特異性和試劑盒的檢測準確度。提純的病毒有典型核蛋白紫外吸收曲線，A260/A280大于I. 5， 提純產量超過2. 0mg/100g。試劑盒中，包被有CoxB組抗原層的多孔酶聯板可采用常規方法將抗原包被至酶聯板上后，而后用封閉液封閉的方式制得。試劑盒中除包括上述物質外，還可包括常規ELISA測試時所需要的試劑、工具或容器，如蒸餾水或去離子水、洗液滴瓶、試管以及說明書等。本專利技術的CoxB IgG/IgM酶聯免疫法檢測試劑盒特異性與靈敏度高，操作時間短， 可用于多人份定性檢測CoxB IgG/IgM。具體實施例方式以下列舉具體實施例進一步闡述本專利技術，應理解，實例并非用于限制本專利技術的保護范圍。實施例ICoxB組抗原的制備試劑細胞維持液2%小牛血清1640維持液(1640粉、NaHCO3、抗菌素、小牛血清、H2O)細胞培養液10%小牛血清1640培養液(1640粉、NaHCO3、抗菌素、小牛血清、H2O)制備步驟I、取0.5ml Cox BI病毒本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：崔貽芬，
申請(專利權)人：上海堯浩生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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