一種石斑魚α干擾素衍生物的制備方法與應用技術

本發明專利技術公開了一種石斑魚α干擾素衍生物的制備方法與應用。該方法包括以下步驟：1)用氨基保護劑封閉石斑魚α干擾素中賴氨酸殘基的ε氨基，得到ε氨基被封閉的石斑魚α干擾素；2)使所述ε氨基被封閉的石斑魚α干擾素的位于氨基端的α氨基和醛基化的單甲氧基聚乙二醇發生親核取代反應；反應完畢后，去除所述氨基保護劑，得到所述石斑魚α干擾素衍生物。所述石斑魚α干擾素衍生物為石斑魚α干擾素的α氨基與醛基化的單甲氧基聚乙二醇發生親核取代反應形成酰胺鍵后生成的化合物，分子量為38KD。使用本發明專利技術的方法得到的石斑魚α干擾素衍生物修飾率約為30％以上，分離純化后純度可達95％以上，半衰期為石斑魚α干擾素的3倍，活性為石斑魚α干擾素的70％。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種石斑魚α干擾素衍生物的制備方法與應用，屬于蛋白質類藥物修飾領域。
技術介紹
我國海域中有1700多種魚類，種質資源豐富，品種多樣，但制約魚類養殖的病毒性疾病已成為限制魚類養殖的最大障礙，并且由于魚類不同于陸地動物，其通過疫苗預防控制魚類疾病的方法受到接種方式、擴散方式等的多方面制約。因此，通過魚類干擾素來控制病毒病已逐步成為首選。但由于蛋白質類藥物自身的一些缺點制約了其進一步發展①穩定性差，易被胃腸道內蛋白水解酶水解，難以口服給藥；②較高的免疫原性，易引起發熱、過敏等不良反應； ③半衰期短，進入機體后易被循環系統清除，生物利用度低，頻繁給藥增加了工作量且造成極大地痛苦。為了提高療效，延長半衰期，降低免疫原性等，國內外學者對干擾素等蛋白質類藥物的修飾技術進行了深入的研究，包括脂質體、多糖緩釋技術，以及基因突變，共價修飾等，其中，聚乙二醇(PEG)共價修飾技術能有效改善藥物體內分布和藥動學性質，是近十幾年來應用較廣的改進蛋白質類藥物藥動學性質的新技術，并在人類已廣泛應用于臨床。聚乙二醇是由環氧乙烷與水或乙二醇不斷加成聚合而成的高分子化合物。有學者將PEG注射小鼠做實驗發現PEG為基本無毒的化學物質，且廣泛應用于化妝品、食品和制藥等行業。聚乙二醇易溶于水及乙醚、己烷等有機溶劑，在水溶液中，PEG為高度水合的聚合物，由于其具有高度靈活的骨架以及和水分子的高度結合性，PEG流體動力學體積為相近分子量水溶性蛋白分子的5到10倍，并且，當PEG與蛋白結合后，對這些蛋白的性質幾乎沒有太大的影響，但卻可以在很大程度上提高這些蛋白的溶解度和分子量。由于普通聚乙二醇末端為活性很低的羥基，需要在復雜條件才能夠發生與蛋白質類藥物的共價結合，對蛋白質類藥物的活性造成一定的損失，且不利于大批量生產純化。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種石斑魚α干擾素衍生物的制備方法與應用。該石斑魚α干擾素衍生物的制備方法，包括以下步驟I)用氨基保護劑封閉石斑魚α干擾素中賴氨酸殘基的ε氨基，得到ε氨基被封閉的石斑魚α干擾素；2)使所述ε氨基被封閉的石斑魚α干擾素的位于氨基端的α氨基和醛基化的單甲氧基聚乙二醇發生親核取代反應；反應完畢后，去除所述氨基保護劑，得到所述石斑魚 α干擾素衍生物；所述石斑魚α干擾素衍生物為石斑魚α干擾素的α氨基與醛基化的單甲氧基聚乙二醇發生親核取代反應形成酰胺鍵后生成的化合物，所述石斑魚α干擾素衍生物分子量為38KD ；所述石斑魚α干擾素的分子量為18. 2KD，其氨基酸全序列見序列表序列2。所述步驟2)中所述醛基化的單甲氧基聚乙二醇具體可為丙醛基修飾的單甲氧基封端的直鏈聚乙二醇，分子量為20KD。所述步驟I)中所述氨基保護劑為二甲基馬來酸酐，其用量為所述石斑魚α干擾素氨基端的α氨基和賴氨酸殘基的ε氨基的摩爾數之和的3-5倍，或具體可為O. 2g所述石斑魚α干擾素使用O. 0664g 二甲基馬來酸酐或Ig所述石斑魚α干擾素使用O. 332g 二甲基馬來酸酐；所述封閉是在0°C，pH值為8. 5的磷酸鹽緩沖溶液中進行；所述磷酸鹽緩沖溶液的溶質為43mM的Na2HPO4和14mM的KH2PO4，溶劑為水。所述步驟I)中所述石斑魚α干擾素在所述磷酸鹽緩沖溶液中的含量為2mg/ ml-10mg/ml。所述步驟2)中所述親核取代反應是在如下條件下進行的溫度為37°C，使用 NaBH3CN作為催化劑；所述NaBH3CN的用量與所述步驟I)中所述石斑魚α干擾素摩爾數相同，或具體可為O. 2g步驟I)中所述石斑魚α干擾素使用O. 032g NaBH3CN或Ig步驟I)中所述石斑魚α干擾素使用O. 16g NaBH3CN。所述步驟2)中所述醛基化的單甲氧基聚乙二醇的用量為步驟I)中所述石斑魚α 干擾素摩爾數的2-10倍,或具體可為O. 2g步驟I)中所述石斑魚α干擾素使用2. 63g所述醛基化的單甲氧基聚乙二醇或具體可為Ig步驟I)中所述石斑魚α干擾素使用7.89g所述醛基化的單甲氧基聚乙二醇；去除所述氨基保護劑的方法是將反應體系的PH調至6. O。由以上任一所述方法制備的石斑魚α干擾素的衍生物也屬于本專利技術保護的范圍。所述的衍生物可用于制備病毒抑制劑。使用本專利技術的方法得到的石斑魚α干擾素衍生物，其修飾率約為30%以上，分離純化后純度可達95%以上；半衰期為石斑魚α干擾素的3倍，活性為石斑魚α干擾素的 70%。使用本專利技術的方法可有效地延長干擾素的半衰期，提高干擾素在體內的有效作用時間，最終可得到一種不會產生耐藥性的殺滅病毒的蛋白質類新藥，拓寬了蛋白質類藥物在臨床上的應用。附圖說明圖I為石斑魚α干擾素的原核表達及包涵體的SDS-PAGE鑒定。其中，由左至右依次為分子量標準(從上到下短橫線所指示的片段大小依次為97. 4,66. 2,43. O、 31. 0,20. 1、14. 4kD)、Rosetta(DE3)/pET_GrIFNa-2b、石斑魚 a 干擾素的包涵體、空菌株 Rosetta (DE3)對照、Rosetta (DE3)/pET_2Ia (+)。圖2為石斑魚α干擾素的凝膠過濾層析圖譜及SDS-PAGE鑒定。圖3為石斑魚α干擾素的離子交換層析圖譜及SDS-PAGE鑒定。圖4為Superdex 75分離純化實施例2和3制備的聚乙二醇-石斑魚α干擾素后SDS-PAGE鑒定。其中，A為未修飾的游離石斑魚α干擾素，B為聚乙二醇修飾的石斑魚 α干擾素。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例所用的醛基化的單甲氧基聚乙二醇是丙醛基修飾的單甲氧基封端的直鏈聚乙二醇，又稱為單甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量為20kD。實施例I、石斑魚α干擾素(GrIFNa _2b)的制備與純化I)將序列表中序列I所示的石斑魚α干擾素成熟肽基因用NdeI和XhoI酶切后連接到質粒pET-21 a (+)(默克化工，69740)的Nde I和Xho I位點得到重組表達載體 ρΕΤ-GrIFNa-2b。其中，序列表中序列I所示的石斑魚α干擾素成熟肽基因編碼序列表中序列2的多肽。2)將pET-GrIFN a -2b轉入菌株Rosetta (DE3)(購自全式金生物科技有限公司)的感受態細胞，得到含有重組表達載體pET-GrIFNa-2b的重組菌Rosetta(DE3)/ pET-GrIFNa-2bο將pET_21a(+)轉入菌株Rosetta(DE3)(購自全式金生物科技有限公司) 的感受態細胞，得到含有空載體的對照重組菌Rosetta (DE3)/pET-21a(+)。將重組菌Rosetta (DE3)/pET-GrIFNa -2b 和 Rosetta (DE3)/pET-2Ia (+)分別于 LB 液體培養基中37°C培養3小時，提取包涵體(用超聲破碎細胞，12000rpm離心，將沉淀溶于 8M鹽酸胍水溶液中)，進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖I所示。3)將步驟2)得到的包涵體3ml約60mg逐滴加入到500ml復性液(由IOOmM Tris · Cl、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM還原型谷胱甘肽和O. 5mM氧化型谷胱甘肽本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：夏春，李奇潤，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：