本發明專利技術提供一種促甲狀腺激素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)，適用于新生兒甲狀腺素低下的臨床篩查。其特征在于包括下述步驟：(1)通過特定色譜柱分離抗體結合物(Eu-Anti-TSH)與游離稀土離子(Eu3+)；(2)標記時采用雙功能螯合劑(DTTA)，其一端螯合稀土離子(Eu)，另一段可與蛋白質的-NH2連接；(3)在增強液中加入β-NTA，通過調整其濃度使得最終試劑的熒光強度得到提高；(4)在分析緩沖體系中加入疊氮鈉替代品Proclin300。根據本發明專利技術上述步驟中的各項特征，可用來生產促甲狀腺素定量檢測試劑盒“時間分辨熒光免疫法”，也可用于開發其它項目的體外診斷檢測試劑。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及免疫診斷應用
，具體而言，本專利技術提供了一種利用時間分辨熒光免疫法，采用Eu標記的抗體與固相載體上的抗體結合抗原上不同位點的“雙抗體夾心”技術，定量檢測采集在903#濾紙上的新生兒全血樣品中促甲狀腺素(TSH)的濃度，主要用于新生兒甲狀腺功能低下的篩查。
技術介紹
“時間分辨熒光免疫分析”理論是芬蘭的Soini和Hemmila于1979年在首次提出， 1984車，Hemmila確定了時間分辨免疫分析技術方案。目前國內用于檢測新生兒血中促甲狀腺素濃度最廣泛的實驗方法是酶法和熒光法。雖然酶是一種理想的標記物，但對于測量酶反應生色產物OD值的酶法其靈敏度難以對高濃度待測物直接準確定量。常規熒光分子為標記物的傳統熒光法由于受到散射光，不同來源的背景熒光以及熒光淬滅等因素的影響分析靈敏度一般為10_8 lO—nmol/L，只限于測定一些對靈敏度要求不高的待測物以及某些小分子。時間分辨熒光免疫法集酶標記技術和同位素標記技術的優點于一身，其反應產物穩定性高，具有高度可檢測性，高分析靈敏度一般為10_18mOl/L，寬的測量范圍，優良的分析精密性，試劑壽命更長，操作簡便是目前最具優勢的檢測方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種采用時間分辨熒光免疫法，定量檢測促甲狀腺激素濃度的試劑盒。本專利技術采用時間分辨熒光免疫法，所制備的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒檢測靈敏度高，檢測范圍寬。本專利技術進一步目的是提供更適用于新生兒甲狀腺功能低下癥的篩查方法。本專利技術提供的采用時間分辨熒光免疫法，其包含下述步驟(1)將TSH單克隆抗體包被到96孔板上；(2)將稀土離子Eu標記到TSH單克隆抗體上；(3)通過特定色譜柱分離純化Eu-Anti-TSH結合物與游離Eu3+ ；(4)增強液的制備；(5)在分析緩沖體系中加入疊氮鈉替代品ft~OClin300。本專利技術提供一種促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，適用于新生兒甲狀腺素低下的臨床篩查。具體檢測方法來源于時間分辨熒光免疫(TRFIA)技術。本專利技術也提供一種標記抗體的方法。將帶有稀土離子的雙功能螯合物標記到TSH 抗體上，在中性或接近中性的條件下，抗體結合物具有足夠高的絡合穩定性。本專利技術也提供一種抗體分離純化的方法。為了獲得高活性和高純度的抗體，本發3明通過kphadex G-50色譜柱分離抗體結合物與游離稀土離子。根據本專利技術，上述用于制備時間分辨熒光免疫試劑中所需抗體結合物的提純方法，都可以應用kphadex G-50色譜柱分離抗體結合物與游離稀土離子。本專利技術以公知的方法研制用于TSH時間分辨熒光免疫法的試劑，通過雙功能螯合物標記上稀土離子，再運用色譜柱分離抗體結合物與游離稀土離子。制備出抗體結合物。將標記分離抗體的方法應用于TSH試劑盒(時間分辨熒光免疫法)中試劑的制備，也包括任何可用于雙抗夾心法原理的檢測項目。例如HCG (促性腺絨毛膜激素)，AFP (甲胎蛋白)，可根據需要提純標記抗體。增強液的制備方法。可用于各種時間分辨熒光免疫法檢測項目中的增強液效能的提高，例如HCG，AFP。根據本專利技術，以公知的方法研發TSH檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)中的試齊U。例如，將帶有稀土離子的雙功能螯合物標記到抗體上，再運用色譜柱分離抗體結合物與游離稀土離子，制備出Eu-抗體。增強液的制備。抗體包被培養板。用TSH單克隆抗體包被96孔培養板，從而制備出時間分辨熒光免疫法定量檢測試劑盒中的TSH包被板。為了提高增強液的效果，在增強液中加入β -ΝΤΑ，通過調整其濃度使得最終試劑的熒光強度得到極大的提高，同時也提高了試劑的反應靈敏度。從而制備出時間分辨熒光免疫法定量檢測試劑盒中的增強液試劑。促甲狀腺素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)中的Eu-抗體制備方案，可用于生產促甲狀腺素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)，也可用來開發新的時間分辨熒光免疫法定量檢測試劑盒。促甲狀腺素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)中的增強液制備方案，可用于生產促甲狀腺素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)，也可應用于其它的時間分辨熒光免疫法定量檢測試劑盒。促甲狀腺素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)中的分析緩沖體系中加入疊氮鈉替代品ft~OClin300，可用于生產促甲狀腺素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)，也可應用于其它檢測項目的時間分辨熒光免疫法定量檢測試劑盒。附圖說明圖1 標記免疫技術的理論檢測靈敏度圖示。圖2 抗體標記技術。圖3 雙抗夾心法示意圖。圖4 TRFIA 配基標記物 β -NTA。具體實施例方式為使本專利技術的內容更為明確，以下為促甲狀腺激素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)中試劑的重點制備操作過程。 1、Eu-Anti-TSH標記并分離抗體的流程 (1)用雙蒸水溶解Eu3+螯合物；(2)待溶解后，取Img Eu3+螯合物溶液加入到Img TSH單克隆抗體溶液中，室溫反應 48h ；(3)通過kphadex G-50色譜柱分離Eu-Anti-TSH結合物與游離Eu3+ ；(4)收集熒光計數大于100萬的洗脫液，即為Eu-Anti-TSH結合物。2、制備增強液主要原料名稱冰乙酸，Triton X-100 (曲拉通X-100，聚乙二醇辛基苯基醚)，0. IM 鄰苯二甲酸氫鉀(KHP)，β-ΝΤΑ(β-萘甲酰三氟丙酮)，Τ0Ρ0(三辛基氧化磷)，ft~OClin300， 配置方法見下表。增強液配方權利要求1.促甲狀腺素定量檢測試劑盒“時間分辨熒光免疫法”，其特征在于包括下述步驟(1)通過色譜柱分離抗體結合物與游離稀土離子；(2)標記時采用雙功能螯合劑，其一端螯合稀土離子，另一段可與蛋白質的-NH2連接， 在中性或接近中性PH條件下，雙功能螯合劑對稀土離子具有足夠高的絡合穩定性；(3)在增強液中加入β-NTA，通過調整其濃度使得最終試劑的熒光強度得到提高；(4)在分析緩沖體系中替換傳統生產中常規使用的疊氮鈉。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的標記有稀土離子的雙功能螯合物有氯磺化鄰三聯苯(BTBCT)，二乙三胺五乙酸(DTPA)，異硫氰酸苯基二乙胺四乙酸(EDTA)，優選異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸(DTTA)。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的稀土離子有Eu3+，Tb3+，Dy3+，Sm3+，優選Eu3+。4.根據權利要求1所述的方法，其中所述的增強液中加入β-ΝΤΑ，通過調整其濃度使得最終試劑的熒光強度得到極大提高，同時也提高了試劑的反應靈敏度。5.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟(1)的分離方法是通過色譜柱分離優選的是kphadex G-50色譜柱。6.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟(4)的疊氮鈉替代物為ftOclin300，在分析緩沖液體系中加入了 PrOClin300，防止了疊氮鈉在生產配置和試驗廢棄物排放時對環境造成的危害。7.根據權利要求6所述WkphadexG_50色譜柱可用來生產促甲狀腺素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)，也可用來制備其它稀土離子標記的抗體。8.根據權利要求4所述的增強液β-NTA可用來生產促甲狀腺素定量檢測試劑盒(時間分辨熒光免疫法)中的增強液，也可用來制備其它時間分辨熒光免疫法試劑盒中的增強液。9.根據權利要求6所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王曉華，
申請(專利權)人：北京協和洛克生物技術研究開發中心，
類型：發明
國別省市：
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