本發明專利技術涉及一種是用于預防仔豬水腫病的stx2e毒素亞單位滅活疫苗的制備方法。本發明專利技術是用產類志賀氏毒素II型變異體(stx2e毒素)的大腸埃希氏菌，接種于適宜培養基培養，提取stx2e毒素亞單位抗原，滅活后與油佐劑混合乳化制成。用于預防仔豬水腫病。本發明專利技術所涉及的仔豬水腫病的stx2e毒素亞單位滅活疫苗使用劑量小，免疫效力高，安全性好，對仔豬的生長沒有任何不良影響，為防治仔豬水腫病奠定了堅實的基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種仔豬水腫病毒素亞單位滅活疫苗的生產方法，屬于生物
，特別是屬于獸用生物制品行業。
技術介紹
仔豬水腫病是嚴重阻礙著養豬業發展的常見疾病之一，其發病急，死亡快，死亡率極高，發病后往往來不及治療就死亡，常造成養殖業主較大經濟損失。經過幾十年的深入研究，人們對水腫病的發病機理有了比較詳細的了解，明確了仔豬水腫病的發生與產類志賀氏毒素II型變異體(stx2e毒素)的大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌(Escherichia coli)的兩個致病因子 ~F18ab 菌毛和 stx2e 毒素密切相關(Imberechts H, De Greve, Schlicker C, et al. Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli st rain F107/86. Microb Pat hog S印，1996,21 (3) :183-192.) o F18ab菌毛為黏附因子，可黏附于小腸絨毛膜上從而使細菌得以定居，并大量分泌stx2e毒素，該毒素是仔豬水腫病的直接致病因子，該病的臨床癥狀和病理變化均由其引發。stx2e毒素是一種蛋白外毒素，不但具有很高致病性，也具有很強的免疫原性，用其制備滅活疫苗可以有效預防仔豬水腫病的發生(Wieler L H, Franke S，Menge C，et al. Investigations on the immunoresponse during edema disease of piglet s after weaning by using a recombinant B subunit of shiga21ike toxin II e.Dtsch Tierarztl Wochenschr, 1995，102 :40-43.)。stx2e毒素是一種高致病性毒素，臨床分離株往往只需分泌少量的毒素就足以對仔豬致病，甚至致死，因此臨床分離株在人工培養條件下往往很難大量培養出該毒素。我們對原用于產志賀氏菌菌素的培養基進行改進，對培養基的組份和成分含量進行優化，大大提高了培養基產stx2e毒素的產量和產毒效率，所生產的stx2e毒素毒性高，滅活后免疫原性強，這為制備高效的預防仔豬水腫病的stx2e毒素亞單位疫苗奠定了堅實的基礎。在此基礎上，我們進行了仔豬水腫病毒素亞單位疫苗的研制工作。研制結果表明， 我們研制的亞單位疫苗使用劑量小，免疫效力高，安全性好，對仔豬的生長沒有任何不良影響，為防治仔豬水腫病奠定了堅實的基礎。
技術實現思路
一、生產用菌株I.菌株來源制造和檢驗用仔豬水腫病的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株由本申請人分離、鑒定、保存和供應，該菌株已于2011年11月22日送交北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為 CGMCC No. 5484。2.菌株特點(I)形態和生化特性本菌株為革蘭氏陰性桿菌，兩端鈍圓，大小為0.4 O. 7umX2 3um;能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖，產酸產氣，IMViC試驗(吲噪、甲基紅、V-P、枸橡酸鹽試驗)反應為-、+、-、-。(2)培養特性菌種在SB固體培養基上，36 37°C培養20小時，菌落光滑、圓整、濕潤，直徑I 2mm。在SB液體培養基中，36 37°C培養20小時，呈均勻一致混濁。(3)血清學特性用O抗原定型血清進行血清型鑒定，應為0139。(4)stx2e毒素毒力鑒定以本菌所提取的stx2e毒素，靜脈注射25 40日齡仔豬， O. 03mg/頭，或腹腔注射體重20g左右昆明小鼠，O. Olmg/只，可使所有試驗仔豬或小鼠發生以后肢癱瘓、共濟失調為特征的神經癥狀，甚至死亡。二、stx2e毒素亞單位疫苗的制備方法I生產用種子制備將大腸埃希氏菌EDQD株(由青島易邦生物工程有限公司分離、 鑒定、保存)凍干的菌種接種改良SB液體培養基(見附件I)，接種固體瓊脂平板，挑取典型菌落若干，經PCR鑒定毒素基因合格后(見附件3)，即可用于接種。2菌液培養采用發酵培養法對大腸埃希氏菌EDQD株進行培養，發酵培養基為改良SB培養基。3毒素提取采用不同飽和度硫酸銨沉淀方法進行毒素提取。提取毒素重懸與原菌液體積1/20,經Bradford法(見附注2)測定蛋白含量，以滅活毒素蛋白含量彡48mg/ml為合格。經戊二醛溶液滅活后，置2 8°C保存備用。4水相配制取滅活檢驗合格的stx2e毒素液，調整蛋白濃度至48mg/ml，按4%終濃度加入滅菌的吐溫-80，加入配液罐中，開啟攪拌電機，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。5油相制備取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸鋁I份加入油相制備罐中，開啟攪拌電機，勻速攪拌，同時開啟導熱油開關，125°C加熱30分鐘，冷卻后，導入貯油 te中備用。6疫苗乳化取油相2份置于乳化罐內，開動電機低速攪拌，同時緩緩加入水相I 份，再以4000r/min攪拌40分鐘。乳化后，取樣IOml,以3000r/min離心15分鐘，若有分層現象，應重復攪拌I次。具體實施例方式本專利技術的實施例進行具體說明I生產用種子制備I. I 一級種子繁殖與鑒定將大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株(CGMCC No. 5484)凍干菌種接種于SB固體培養基(見附件I)，37°C培養18小時，挑取光滑圓整的單個菌落，接種于SB液體培養基中，37 °C振蕩(搖床轉速150r/min左右)培養15小時左右。無菌取少量菌液進行stx2e毒素基因的PCR鑒定，如可擴增出特異性基因片段且純檢合格，則向菌液中按15%終濃度加入甘油，混勻后小量分裝，作為一級種子。在_20°C以下保存，使用期不超過6個月。I. 2 二級種子繁殖取一級種子融化后，按1%比例接種于SB培養基中，37°C振蕩 (搖床轉速150rpm左右)培養15小時左右。無菌取少量菌液進行stx2e毒素基因的PCR 鑒定，如可擴增出特異性基因片段且純檢合格，即可用于擴大培養。在2 8°C保存，應不超過7天。2制苗用stx2e毒素的制備2.1細菌培養按以下條件進行發酵培養二級種子接種量為3%、通氣流量為 200L/分、攪拌速度為150r/min培養時間為5 7小時、培養溫度為36 37°C、消泡劑為 O. 1%花生油。2. 2 stx2e毒素的提取收獲的菌液經連續流離心機離心，菌泥按O. I克/ml比例重新懸浮于生理鹽水中，于冰裕條件下在超聲波破碎儀上作用至90%以上菌體破碎。破碎菌液經連續流離心機離心，取上清于4°C攪拌條件下，緩慢加入將固體硫酸銨直至達到40% 硫酸銨飽和度，繼續攪拌2小時，于4°C經連續流離心機離心，棄去沉淀物，于上清中繼續加入固體硫酸銨至達到60%硫酸銨飽和度，繼續攪拌2小時，于4°C經連續流離心機離心，沉淀重懸與原菌液體積1/20，經戊二醛溶液滅活后，置2 8°C保存備用。2.3 stx2e毒素提取物毒力試驗以本菌所提取的stx2e毒素，腹腔注射體本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：杜元釗，郭玉廣，鄒敏，馬爽，程增青，馮陽，王福軍，李金積，郭莉莉，孫健，
申請(專利權)人：青島易邦生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：
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