一種制備視網膜色素上皮細胞的方法技術

本發明專利技術公開了一種制備視網膜色素上皮細胞的方法，利用LXR受體激活劑誘導干細胞分化為視網膜色素上皮細胞；與現有技術相比，本發明專利技術利用LXR受體激活劑誘導干細胞分化為視網膜色素上皮細胞的方法不使用飼養層，從而避免動物源性飼養層帶來的潛在風險，而且能提高分化效率、縮短分化時間。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，特別涉及制備視網膜色素上皮細胞的方法。
技術介紹
視網膜變性疾病是一類嚴重的致盲性疾病，主要包括視網膜色素變性(Retinal pigment degeneration,簡稱 RP)和年齡相關性黃斑變性(Agerelatedmacular degeneration，簡稱AMD)等。此類疾病發病機理不明、有效防治手段有限，嚴重危害患者的生活質量，每年在全球范圍內造成數千億計的巨大損失。此類疾病的病理過程均是因視網膜色素上皮細胞(Retinal pigmentepithelium,簡稱RPE)的變性死亡所引致。故應用RPE 細胞進行替代性移植治療成為治療此類疾病的重要手段，但RPE細胞來源有限，限制了移植治療的臨床應用。目前人胚胎干細胞(Embryonic stem cell,簡稱ES)誘導分化的RPE 細胞成為了細胞移植治療的研究熱點，已有大量離體及在體實驗證明該細胞具有類似甚至優于原代分離的人的RPE細胞。目前誘導ES向RPE分化的方法為ES細胞在飼養層細胞上達到超級融合狀態后， 加入缺少成纖維細胞生長因子(bFGF)的ES完全培養基使ES的自發分化。該方法的缺點在于，第一，對胚胎干細胞本身具有較高的要求，僅部分細胞株能分化出足夠量的RPE細胞； 第二，分化時間較長，通常4-8周才能形成色素灶；第三，飼養層細胞本身具有抑制干細胞分化的作用，使分化效率低，通常為10-20% ;第四，需要采用飼養層細胞，目前廣泛使用小鼠來源的飼養層細胞，增加了動物源性污染的可能性，也有報道采用人源性的飼養層，但其技術難度較高，且來源有限，難以付諸實施。因此，需要一種不用飼養層也能誘導干細胞分化為視網膜色素上皮細胞的方法， 從而提高分化效率、縮短分化時間，且能避免動物源性飼養層帶來的潛在風險。
技術實現思路
鑒于此，本專利技術的目的是提供一種誘導干細胞分化為視網膜色素上皮細胞(RPE) 的方法，利用核受體肝X受體(Liver X Receptor,簡稱LXR)激活劑誘導干細胞分化,該方法不使用飼養層，從而避免動物源性飼養層帶來的潛在風險，而且能提高分化效率、縮短分化時間。本專利技術提供了，利用LXR受體激活劑誘導干細胞分化為視網膜色素上皮細胞。LXR受體在視網膜多層表達，在RPE細胞的分化中起到重要作用，經試驗5 ii M的LXR受體激動劑具有最佳的促進ES向RPE細胞分化的能力，且無明顯細胞毒性作用。優選的，所述干細胞為人胚胎干細胞；優選的，所述誘導分化包括如下步驟 a.接種干細胞于孔板中，加入干細胞完全培養基，放置培養并定期更換干細胞完全培養基至細胞達融合狀態；b.加入含LXR受體激動劑的誘導分化培養基，放置培養并定期更換誘導分化培養基至細胞分化形成色素灶； c.將色素灶與周邊細胞分離，并接種于孔板中，加入培養基，放置培養并定期更換培養基得視網膜色素上皮細胞。優選的，步驟a中所述干細胞為第20-30代人胚胎干細胞；所述干細胞完全培養基為胚胎干細胞完全培養基，成分為20%血清替代物+1%非必需氨基酸+ImM谷氨酰胺+4ng 成纖維細胞生長因子(bFGF )+0. ImM P -巰基乙醇；所述定期更換干細胞完全培養為每天更換一次；所述融合狀態為超級融合狀態。優選的，步驟b中所述誘導分化培養基為20%血清替代物+1%非必需氨基酸+ImM 谷氨酰胺+5uM LXR受體激動劑+0. ImM P -巰基乙醇；所述定期更換誘導分化培養基為隔天更換一次至2周。優選的，步驟c中所述分離采用的器材為玻璃電極；所述接種采取的接種密度為每孔5-10個色素灶；所述孔板鋪有基質膠；所述培養基為20%血清替代物+1%非必需氨基酸+ImM谷氨酰胺+0. ImM ^ -巰基乙醇；所述定期更換培養基為每天更換一次至4周。優選的，步驟a或/和步驟b或/和步驟c中所述放置培養是在37°C和5% CO2培養箱中進行。與現有技術相比，本專利技術利用LXR受體激活劑誘導干細胞分化為視網膜上皮細胞的方法，不使用飼養層，避免了動物源性飼養層帶來的潛在風險，而且能提高分化效率、縮短分化時間。附圖說明圖I為本專利技術人胚胎干細胞分化形成色素灶示意圖；圖2為本專利技術色素灶邊緣爬出視網膜上皮細胞示意圖；圖3為本專利技術玻璃電極分離的色素灶示意圖；圖4為本專利技術人胚胎干細胞分化的視網膜上皮細胞的免疫熒光鑒定示意圖。 具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本專利技術，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本專利技術的應用范圍。本專利技術不限于下述實施方式或實施例，凡不違背本專利技術精神所做出的修改及變形，均應包括在本專利技術范圍之內。本實施例制備視網膜色素上皮細胞的方法，利用肝X受體(LXR)激活劑誘導干細胞分化為視網膜色素上皮細胞。本實施例中，所述干細胞為人胚胎干細胞，當然也可以采用其他種類的人干細胞或者其他物種的干細胞，均能夠實現專利技術目的，但采用人胚胎干細胞效果較佳。本實施例中,所述誘導分化包括如下步驟a.接種干細胞于孔板中，加入干細胞完全培養基，放置培養并定期更換干細胞完全培養基至細胞達融合狀態；本步驟中，所述干細胞為第20代人胚胎干細胞；所述干細胞完全培養基為胚胎干細胞完全培養基，成分為20 %血清替代物+1 %非必需氨基酸+ImM谷氨酰胺+4ng成纖維細胞生長因子(bFGF)+0. ImM ^ -巰基乙醇；所述放置培養是在37°C和5% CO2培養箱中進行； 所述定期更換干細胞完全培養為每天更換一次；所述融合狀態為超級融合狀態。 b.加入含LXR受體激動劑的誘導分化培養基，放置培養并定期更換誘導分化培養基至細胞分化形成色素灶；本步驟中，所述誘導分化培養基為20%血清替代物+1%非必需氨基酸+ImM谷氨酰胺+5 U M LXR受體激動劑+0. ImM ^ -巰基乙醇；所述放置培養是在37°C和5% CO2培養箱中進行；所述定期更換誘導分化培養基為隔天更換一次至2周。該誘導分化培養基是去除干細胞完全培養基中的bFGF且加入LXR受體激動劑構成，對細胞進行隔天換液，維持2 周，部分ES細胞發生分化形成色素灶如圖I。c.將色素灶與周邊細胞分離，并接種于孔板中，加入培養基，放置培養并定期更換培養基得視網膜色素上皮細胞。本步驟中，所述分離采用的器材為玻璃電極；所述接種采取的接種密度為每孔5 個色素灶；所述孔板鋪有基質膠；所述培養基為20%血清替代物+1%非必需氨基酸+ImM 谷氨酰胺+0. ImM ^ -巰基乙醇；所述放置培養是在37°C和5% CO2培養箱中進行；所述定期更換培養基為每天更換一次至4周。采用本實驗室自制的玻璃電極小心分離色素灶與周邊細胞，挑取色素灶細胞接種于鋪有基質膠的6孔板中(5色素灶/孔)，采用20%血清替代物+1%非必需氨基酸+ImM 谷氨酰胺+0. ImM ^ -巰基乙醇的培養基對細胞進行繼續培養，每3天換液一次，維持4周， 色素灶邊緣爬出RPE細胞如圖2。自制的玻璃電極，不遮擋視野，相較于采用塑料巴氏吸管和顯微手術刀的傳統方法具有更好的可操作性且不易損傷細胞，獲得的色素灶完整如圖3。進一步對人ES細胞分化的RPE細胞做免疫組化鑒定，分化的RPE細胞具有與原代視網膜色素上皮細胞表達重要功能蛋白的能力，如圖4所示胞內視黃醛結合蛋白 (CRALBP)、RP本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陰正勤，曾玉曉，徐海偉，段平，劉俊，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院，
類型：發明
國別省市：