具有基本上均一和未唾液酸化的糖形如G0和G2的抗體制劑，通過酶促處理，在某些條件下進行的表達，特定宿主細胞的使用和用血清進行的接觸來制備。這些抗體制劑能抵抗蛋白酶切割，所述蛋白酶例如木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、基質金屬蛋白酶如MMP-7、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)、溶基質蛋白酶(MMP-3)、巨噬細胞彈性蛋白酶(MMP-12)和糖基化修飾酶。具有基本上均一和未唾液酸化的糖形的抗體制劑及測試抗體中的糖基化情況的方法，可用于鑒定抗體特性和/或用于治療以蛋白酶活性提高為特征的疾病或病癥。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及評估抗體的糖形含量，更具體的說涉及制備和使用基本上均一的糖形(homogeneous glyc oform),例如非唾液酸化糖形的抗體制劑的方法。
技術介紹
抗體是可溶性血清糖蛋白，在先天免疫中起到重要的作用。所有天然產生的抗體其重鏈恒定區中的保守位置處的糖結構隨同種型的不同而不同(圖I)。每種同種型各有獨特的一套N-連接寡糖結構,該結構對蛋白質裝配、分泌或功能活性有不同影響(Wright,A.和 Morrison，S. L ,Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。附接的 N-連接寡糖的結構(圖2)因加工程度的不同相差甚大，可包括高甘露糖以及具有或不具有等分GIcNAc和核心巖藻糖殘基的復雜二天線型寡糖(Wright, A.和Morrison, S. L.同上)。通常，附接在特定糖基化位點的核心寡糖結構會發生不均一加工，使得甚至單克隆抗體也以多種糖形存在。同樣，已證實各種產抗體細胞系之間在抗體糖基化方面差別顯著，而在不同培養條件下生長的特定細胞系中觀察到的差別不顯著。在各種抗體同種型(例如IgE、IgD、IgA、IgM和IgG)中，IgG最為豐富,其中IgGl亞類顯示最顯著程度和類別的效應子功能。IgGl類型的抗體在通常認為其中ADCC和⑶C活性重要的癌癥免疫療法中是最常用的抗體。在結構上，IgG鉸鏈區和CH2結構域在抗體效應子功能中起到主要作用。Fe區中存在的N-連接寡糖(通過鉸鏈、CH2和CH3結構域的二聚化形成)會影響效應子功能。這些共價結合的寡糖是復雜的二天線型結構，且高度不均一(heterogeneous)(參見圖 2) ；NANA>5-N-乙酸神經氨酸(NeuAc)或 NGNA、5_N_ 輕乙酸神經氨酸(NeuGc)是通常的“唾液酸”。其它唾液酸已被發現或可化學合成。每個CH2結構域中Asn297處為保守N-連接糖基化位點。在成熟抗體中，附接到Asn297的兩個復雜二天線型寡糖隱藏在CH2結構域之間，與多肽骨架形成廣泛的接觸。已發現它們的存在對于抗體介導效應子功能如 ADCC 是必要的(Lifely，M. R.等，Glycobiology 5:813-822(1995)；Jefferis, R.等，Immunol Rev. 163 :59-76 (1998) ;Wright, Α·和 Morrison, S. L.同上)。已開始研究特定位置處的各個糖類的生物學存在和意義。例如，抗體糖基化的程度受年齡、性別和疾病的影響(Raju, T.S.等，Glycobiology 2000. 10(5) :477-86)。一般來說，寡糖結構有一定的物種特異性，因此相差甚大。此外，還研究了具有和不具有等分GlcNAc和核心巖藻糖殘基的寡糖結構的生物學意義。人IgG和許多重組產生的IgG含有少量的唾液酸化(或者未唾液酸化(unsialylated)或無唾液酸化(asialyated))寡糖,但是，大多數IgG含有非唾液酸化(non-sialylated)寡糖結構。抗體的蛋白酶解切割通常在生理條件下發生，這也可以是基于抗體結構的生物治療藥物的生產中的一個工業加工步驟。木瓜蛋白酶產生或加工的治療性抗體片段Fab正得到更為廣泛的使用。盡管木瓜蛋白酶是植物來源的酶，但在IgGl鉸鏈中鑒定出多個蛋白酶切割位點，總結于圖3。 可用不同的蛋白水解酶將重組I gG轉變成I gG片段，如Fab和F (ab ’)2及Fe (圖I和圖3)。各消化片段代表了可用于控制和治療人類疾病的主要生物治療藥物類別。阿昔單抗(abciXimab，c7E3 Fab,以商標REOPRO 市售)是Fab治療藥物的一個實例。該47，615道爾頓Fab片段從細胞培養上清液純化并經木瓜蛋白酶消化和柱層析得到。其它實例包括=DigiFab(DigiTAB)，從綿羊多克隆抗體制得的Fab片段制劑，用于地高辛中毒的潛在治療；CroFAb，從免疫了蛇毒液的綿羊獲得的單價Fab片段制劑，作為抵御四種最常見北美響尾蛇咬傷的抗蛇毒素，美國2000年10月批準；和EchiTAb，基于單特異性綿羊多克隆抗體的Fab片段的抗蛇毒素,用于治療西非常見的地毪毒蛇(carpet viper,Echis Ocellatus)的咬傷。其它開發中的 Fab 包括ranibizumab (rhuFab V2 ；AMD-Fab ;Lucentis), Genentech的貝伐單抗的高親和力Fab變體，作為年齡相關性黃斑變性的潛在治療藥物；和5G1. 1，為能防止人補體成分C5被切割成其促炎成分的靜脈用人源化單克隆抗體，作為幾種慢性炎性疾病，包括類風濕性關節炎(RA)、膜性和狼瘡性腎炎、皮肌炎和陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)的潛在治療藥物。其它具有潛在治療用途的含Fab組合物包括化學修飾Fab如⑶P-870，它是連接到聚乙二醇(PEG)的人源化抗TNF a -Fab片段。CDP-870衍自小鼠抗人TNF α抗體，該抗體因其高親和力結合和中和潛力而被選擇。這個抗體的Fab片段通過重組DNA技術構建、人源化并在大腸桿菌中通過補料-分批發酵合成。這個發酵程序的產率達到300至1200mg蛋白質/升細菌培養物。為提高血漿半壽期，將PEG部分加到Fab片段。出于這個目的，開發了位點特異性綴合方法，其中將單個半胱氨酸殘基引入到Fab片段的鉸鏈區中，以便為了提高其循環半壽期的目的共價加入親水性聚合物(PEG)。比起在哺乳動物細胞培養物中常規生產的抗體，使用低成本的大腸桿菌技術來生產Fab片段，讓生產商(Celltech)降低OTP-870的制造成本10至20倍。大腸桿菌不表達糖基化蛋白質。至今為止還沒有探明聚糖存在和組成與IgG對人類或其它物種中的蛋白酶解切割的易感性之間的關系。因此，需要認識治療相關抗體結構的蛋白酶解模式與聚糖結構之間的關系，目的是為了有效生產抗體，并作為鑒定抗體聚糖的存在和/或組成的工具。專利技術概述本專利技術包括提高抗體制劑抵抗蛋白酶切割的能力的方法，和使用這種抗體制劑治療與高水平的蛋白酶的存在有關的病理狀況如癌癥的方法。在本專利技術方法的一個實施方案中，抗體制劑在抗體的Fe區中基本上不含唾液酸化糖形。在本專利技術的另一個方面，蛋白酶選自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、包括MMP-7在內的基質金屬蛋白酶、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)、溶基質蛋白酶(MMP-3)、巨噬細胞彈性蛋白酶(MMP-12)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和包括糖基化修飾酶如唾液酸酶-A、半乳糖苷酶等在內的其它蛋白酶。在一個實施方案中，將抗體制劑進行修飾，以使在糖形GO方面基本上是均一的。在另一個實施方案中，本專利技術包括提高或降低抗體制劑抵抗蛋白酶切割的能力的方法，和將這種抗體制劑用于與升高或減低水平的蛋白酶的存在有關的疾病或病癥的方法。本專利技術還包括通過用唾液酸酶體外處理抗體制劑，并任選用β -半乳糖苷酶和/或α -半乳糖苷酶進一步處理抗體以除去半乳糖殘基，來提高抗體對蛋白酶的穩定性的方法，所述蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、包括ΜΜΡ-7在內的基質金屬蛋白酶、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)、溶基質蛋白酶(ΜΜΡ-3)、巨噬細胞彈性蛋白酶(ΜΜΡ-12)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
...
【專利技術屬性】
技術研發人員：T·S·拉于，B·斯卡倫，
申請(專利權)人：詹森生物科技公司，
類型：發明
國別省市：
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