一種檢測Tgf2轉座子在金魚基因組插入側翼序列和拷貝數的方法技術

本發明專利技術涉及一種檢測Tgf2轉座子在金魚基因組插入側翼序列和拷貝數的方法：通過對帶有Tgf2轉座子的金魚基因組DNA提取；再對全基因組DNA進行限制性內切酶酶切；酶切好的DNA片段與splinkerette接頭連接；接下來分別進行第一輪PCR和第二輪PCR分別擴增轉座子插入位點5'和3'側翼序列，對第二輪PCR產物進行克隆和序列測定，從而檢測出Tgf2轉座子在魚類基因組側翼序列，并推測插入的拷貝數。本發明專利技術優點在于：具有簡便、高效和低成本特點，可為利用Tgf2轉座子介導的其他魚類基因組插入誘變和轉基因后代的拷貝數和側翼序列的檢測提供快速、準確的方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及魚類基因工程領域，具體地說，是，及其在金魚Tgf2轉座子插入位點檢測中的應用，適用于在金魚和養殖魚類Tgf2轉座子介導的轉基因或插入誘變后代中進行快速準確的開展基因組插入拷貝數和側翼序列的鑒定。
技術介紹
DNA轉座子(transposon)是一類能在宿主基因組中變更插入位置的可移動遺傳因子，其變更插入位置的過程稱為轉座(transposition)。很多不同的轉座子(如P因子和Mosl)介導的基因組插入誘變已被作為大規模遺傳篩選的工具，不僅在單細胞生物如細菌和酵母中，而且在多細胞生物包括蠕蟲、果蠅和擬南芥的研究中都被證明是成功的，它們為發現和解碼這些生物的性狀主控基因作出了巨大的貢獻。近年來，我們在一些金魚品系中發現了一個新的、具有天然轉座活性MT家族轉座子，為近年發現的第二例具有天然轉座活性的脊椎動物轉座子，根據國際轉座子的命名標準，命名該轉座子為Tgf2轉座子。Tgf2轉座子來源于鯉科魚類，其在鯉科養殖魚類中的轉基因整合率約為50%，是第I代線性化質粒注射方法的10倍。與昆蟲PiggyBac轉座子傾向插入TTAA和Tcl/mariner轉座子家族偏好AT位點相比，鯉科Tgf2轉座子為隨機插入，這為開辟鯉科養殖魚類全基因組插入誘變研究奠定了物質基礎。目前，進行轉座子在生物基因組插入拷貝數和側翼序列一般采用反向PCR(inverse PCR)方法。反向PCR在擴增前先用限制性內切酶酶切樣品基因組DNA，再用DNA連接酶連接成一個環狀DNA分子，然后通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段，并進行測序，從而獲得插入拷貝數的側翼序列和拷貝數。反向PCR方法存在一些缺點和不足，例如，I、酶切、自連過程受到很多不確定因素的影響，需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段，這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA ;2、為提高分子間連接的效率，連接反應中基因組DNA的濃度要低，因為高濃度的DNA可能會提高非同源連接水平，從而產生非特異擴增；3、成環的雙鏈DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反應，它只可以擴增出較短的DNA片段；4、魚類轉座子插入位點存在多拷貝，反向PCR引物可能與多個基因序列雜交，嚴重干擾轉座子插入位點側翼序列的鑒定。中國專利文獻CN101962659A公開了一種基于Tgf2轉座子的魚類基因轉移載體及其制備方法，由轉基因供體質粒和輔助質粒組成，轉基因供體質粒由魚類啟動子序列，如斑馬魚KrtS啟動子、目的基因、以及金魚Tgf2轉座子左右臂序列構建，輔助質粒由斑馬魚β -actin啟動子和金魚Tgf2轉座酶編碼基因構建，為進行魚類轉基因研究提供了新方法。中國專利文獻CN101962660A公開了一種基于Tgf2轉座子的魚類轉基因方法及其載體和載體的制備方法，通過注射轉基因供體質粒，并輔以基于Tgf2轉座酶mRNA兩種載體，共同注射入魚類1-2期細胞期受精卵，即可實現高效轉基因，與常規魚類轉基因技術相比，具有整合效率高、負載容量大、通用、安全和高效的優點。但是關于目前還未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中的不足，提供。為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案是，所述的方法包括以下步驟(I)通過對帶有Tgf2轉座子的金魚基因組DNA提取；(2)再對全基因組DNA進行限制性內切酶酶切；(3)酶切好的DNA片段與splinkerette接頭連接；(4)接下來分別進行第一輪PCR和第二輪PCR分別擴增轉座子插入位點5’和3’側翼序列，對第二輪PCR產物進行克隆和序列測定，從而檢測出Tgf2轉座子在魚類基因組側翼序列，并推測插入的拷貝數，所述的檢測出的Tgf2轉座子在魚類基因組側翼序列數即為插入的拷貝數。 所述的步驟(I)中的金魚基因組DNA帶有Tgf2轉座子插入位點，包括基因組本身帶有Tgf2轉座子的金魚各品系，以及通過轉座方式插入Tgf2轉座子的其他魚類。所述的步驟(2)中的限制性內切酶為Sau3Al，酶切好的DNA片段帶有"GATC"粘性末端。所述的步驟(3)中的splinkerette接頭包含長序列SEQ ID No: I和短序列SEQID No:2。所述的splinkerette接頭的合成步驟為把權利要求4所述的splinkerette接頭長序列與短序列等濃度等體積混合，95°C保溫5min，然后以1°C /15s逐步降至4°C，長序列與短序列退火形成splinkerette接頭。所述的splinkerette接頭一側帶有段序列的"GATC"粘性末端，另一側帶有由于短序列中的AT堿基互補配對形成一個7bp的發卡結構而形成錯配區。所述的步驟(3)中酶切好的DNA片段與splinkerette接頭均帶有〃GATC〃粘性末端，通過T4連接酶連接,形成酶切DNA片段兩端帶有splinkerette接頭的DNA片段。所述的步驟(4)中進行轉座子插入位點5’側翼序列擴增的第一輪PCR，所用引物為 Splinkl :SEQ ID %:5和18€2-5’65卩3: SEQ ID No: 3 ;對第一輪PCR產物稀釋50倍，并進行第二輪 PCR，所用的引物為Splink2: SEQ ID No:6 和 Tgf2_5’GSP4 :SEQ ID No:4，對第二輪PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5 α中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉座子在金魚基因組5’側翼序列，并推測出插入拷貝數。所述的步驟(4)中進行轉座子插入位點3’側翼序列擴增的第一輪PCR，所用引物為Splinkl: SEQ ID No: 5和 Tgf 2-3’GSPl: SEQ ID No: 7 ;對第一輪 PCR 產物稀釋 50 倍，進行第二輪PCR，所用的引物為Splink2: SEQ ID吣:6和了8€2-3’65卩2: SEQ ID No:8，對第二輪PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5 α中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉座子在金魚基因組3’側翼序列，并推測出插入拷貝數。本專利技術優點在于1、可在金魚基因組Tgf2轉座子插入后代中，進行快速準確的開展基因組插入拷貝數和側翼序列的鑒定； 2、本專利技術與現有技術相比，具有簡便、高效和低成本特點，可為利用Tgf2轉座子介導的其他魚類基因組插入誘變和轉基因后代的拷貝數和側翼序列的檢測提供快速、準確的方法。附圖說明附圖I是金魚基因組提取瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖2是合成的帶有"GATC"粘性末端和一個7-bp發卡結構的splinkerette接頭圖譜。附圖3是金魚基因組DNA用限制性內切酶Sau3Al酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖4是Splinkerette PCR法擴增Tgf2轉座子5’側翼序列的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖5是Tgf2轉座子在金魚基因組插入區5’端的序列比對結果。附圖6是Splinkerette PCR法擴增Tgf2轉座子3’側翼序列的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖7是Tgf2轉座子在金魚基因組插入區3’端的序列比對結果。附圖8是Tgf2轉座子插入金魚基因組的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖9是Tgf2轉座子插入金本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄒曙明，田玉梅，蔣霞云，
申請(專利權)人：上海海洋大學，
類型：發明
國別省市：