一種草魚水霉病疾病模型的建立方法技術

本發明專利技術提供了一種草魚水霉病疾病模型的建立方法，所述的方法選自下列方法中的一種：1）將草魚刮傷后置于含水霉孢子1×103～1×105個/mL的水體中，25℃下恒溫養殖；2）將草魚刮傷后置于含水霉孢子1×103～1×105個/mL的水體中，使水溫在1h內降低8～12℃或者使水溫在1h內升高8～12℃，養殖，優選將25℃下養殖的草魚刮傷后置于含水霉孢子1×103～1×105個/mL的水體中，使水溫在1h內由25℃降低至15℃，養殖48h。本發明專利技術的方法成功地建立了草魚水霉病模型，且感染率高、感染速度快、成功重復率高，克服了水霉病發病不確定、難以收集水霉病魚體的缺陷，為水霉病的研究和防治提供了重要的手段和工具，適于普遍推廣使用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及試驗動物疾病模型的建立方法，具體地說，是。
技術介紹
水霉病(Saprolegniasis)又叫膚霉病(Dermatomyucosis),是由絲狀真菌引起的一種水產養殖常見病害，其中最主要的病原是水霉(Saprolegnia)和綿霉(Achlya)兩個屬的種類，二者均屬于水霉科(Saproleniaceae)。水霉對寄主無嚴格選擇性,各種水產動物從卵到各齡成體都可感染。一般認為水霉是腐生性的，對水產動物是一種繼發感染。養殖動物受傷或因組織的營養而迅速生長，致命組織發炎、壞死，魚體負擔過重，游動失常，食欲減退，很快瘦弱死亡。長期以來，水霉病的防治是魚類病害防治中最棘手的一個難題之一。為了更有效的防治水霉病，現在許多國家的研究者致力于這方面的研究工作，而水霉病疾病模型的建立則是水霉病防治研究中的重要一環。魚類試驗動物疾病模型在新漁藥研發過程中起著舉足輕重的作用，新漁藥研發流程有以下四個階段第一個階段是專利技術(發現)階段，第二個階段是非臨床(臨床前)研究階段，第三個階段是臨床研究階段，第四個階段是上市后階段。魚類試驗動物疾病模型一般在第三階段發揮作用，此階段主要確定新漁藥產品是否有進一步研發的意義。該試驗包括試驗動物疾病模型耐受性試驗，尋找有效劑量和中毒劑量范圍，確定試驗動物的有效性和安全性；開展試驗動物疾病模型的藥代動力學及生物利用度試驗，為下步推薦臨床使用劑量提供依據，即用健康靶動物在可控條件下進行藥效對照試驗，并進行魚類試驗動物疾病模型藥代動力學試驗，確定初步的有效劑量，因此也有人稱為劑量確定實驗。試驗動物疾病模型對于學科和技術的發展極為重要，醫學和陸生動植物已建立了包括動物試驗、組織培養和病原保藏中心等在內的數百種標準試驗模型，有力地促進了醫學和陸生動植物病害研究的發展，而水生生物標準的試驗模型(包括組織培養模型、魚類試驗動物疾病模型和病原庫)相對來說數量極少。而目前關于草魚QCtenopharyngodoni而7^ ，屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬)水霉病疾病模型及其建立方法還未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中的不足，提供。為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案是一種草魚iCtenopharyngodon水霉病疾病模型的建立方法,所述的方法選自下列方法中的一種 1)將草魚刮傷后置于含水霉孢子IX IO3 I X IO5個/mL的水體中，25°C下恒溫養殖； 2)將草魚刮傷后置于含水霉孢子IX IO3 I X IO5個/mL的水體中，使水溫在Ih內降低8 12°C或者使水溫在Ih內升高8 12°C，養殖。所述的水霉是多子水霉ferax、。所述的水體是經曝氣、消毒和去氯處理后的自來水。所述的水體pH值是6. 5 6. 8。所述的水體是經下述方法處理的接種水霉至水中，在水溫20 30°C條件下培養霉菌至其濃度為I X IO3 I X IO5個/mL。所述的草魚體重40 55g、體長15 17cm。 所述的草魚是經下述方法刮傷的將背鰭下方兩側鱗片去掉，擦拭去掉鱗片部位的皮膚2 4cm2，并擦拭掉傷口表面的粘液。所述的方法優選將25°C下養殖的草魚刮傷后置于含水霉孢子I X IO3 I X IO5個/mL的水體中，使水溫在Ih內由25°C降低至15°C，養殖48h以上。本專利技術優點在于 I、本專利技術的方法一將草魚刮傷后置于含水霉孢子I X IO3 I X IO5個/mL的水體中，25°C下恒溫養殖，該方法平均可獲得13. 3%的草魚水霉病模型，克服了水霉病發病不確定、難以收集水霉病魚體的缺陷，令研究者可隨時采用實驗性誘發的方法在魚體身上復制出來，取得條件一致的模型材料，為水霉病的研究和防治提供了重要的手段和工具。2、本專利技術的方法——將草魚刮傷后置于含水霉孢子IX IO3 IX IO5個/mL的水體中，使水溫在Ih內降低8 12°C或者使水溫在Ih內升高8 12°C養殖，該建立草魚水霉病模型的方法感染率更高、感染速度更快且成功重復率高，適于普遍推廣使用。附圖說明附圖I是用本專利技術的方法成功感染水霉病的草魚。附圖2是感染水霉病的草魚皮膚表面明顯的黃色水霉菌絲。附圖3是感染水霉病的草魚真皮組織病理切片(HE染色，100 X )。附圖4是圖3的局部放大圖。具體實施例方式下面結合附圖對本專利技術提供的具體實施方式作詳細說明。實施例I I實驗用魚 實驗用草魚購自江蘇南通國營農場，規格為草魚體重是40 55g/尾、體長15 17cm/尾。體表和解剖觀察健康,暫養7天。2菌株來源 水霉菌株為寄生水霉(Saprolegnia parasitica),購于ATCC,即美國模式培養物集存庫(American type culture collection),菌株編號200013。3暫時飼養管理 用200 L容積玻璃缸飼養，增氧器24h增氧；水源為經曝氣、消毒和去氯處理后的自來水，pH 6. 6，平均水溫25°C，溶氧10 mg/L，其他指標符合漁業水質標準。飼料配制參照NRC營養標準。4水霉培養及水體增殖挑取保藏于試管內的水霉菌絲轉接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA，配方馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15克，純水1000毫升，pH自然)培養皿中，25°C培養72h使其鋪滿整個培養皿。取10個培養好水霉的培養皿，將水霉連同培養基取出，裝入紗布袋，系好后放入用于感染的玻璃缸(20L)水中(該水體同步驟3使用的水體相同)，水溫為25°C。將若干事先用水煮開裂的玉米粒放入該玻璃缸水體內，觀察到90%玉米粒有水霉生長，即判斷玻璃缸水體中有水霉存在。其次，將該玻璃缸中的水在顯微鏡下觀察并計數孢子濃度，當孢子濃度IX IO4 spores/mL時,用于感染實驗。5實驗設計 5. I實驗分組 實驗選取三個感染條件刮傷、水溫變化、水霉浸泡，對草魚分別進行獨立的水霉病人工感染實驗。通過不同的條件分組對照確定其中影響水霉病感染的條件，同時優化出最佳的水霉病人工感染方式。具體分組為三條件實驗組刮傷、水溫變化、水霉浸泡組；雙條件實驗組變溫、刮傷組；刮傷、水霉浸泡組；變溫、水霉浸泡組；單一條件對照組刮傷組；水霉浸泡組；變溫組；陰性對照組不刮傷，無水溫變化，無水霉浸泡。每組設三個平行對照缸，每個平行對照缸放草魚5尾。試驗前24h停止給試驗魚喂食，整個試驗期間亦不喂食。5. 2人工感染 用手術刀片將草魚背鰭下方兩側鱗片去掉，并用鋼絲球反復擦拭去掉鱗片部位的皮膚3cm2，將刮傷后的草魚分別放入上述幾組用于感染的玻璃缸水中，其中有變溫條件的實驗組溫度變化通過空調進行控制，水溫因室溫的變化而變化，在Ih內由原水溫25°C下降到15°C。兩天(48h)后即可開始觀察感染結果。5. 3方法可靠性檢驗 對感染效果較好的感染條件組進行重復性實驗，以評價方法的可靠性，建立水霉人工病感染方法。即針對感染效果較好的方法重復進行三次實驗，每次設置三個平行對照缸，同樣每個平行對照缸放草魚5尾。6數據處理 實驗數據以平均值表示，采用SPSS 13. O軟件對方法的可靠性進行F檢驗，評價方法可靠性。P > O. 05表示用該法進行水霉病人工感染各重復次數間無顯著差異，方法可靠性好。7 結果 7. I人工感染結果 觀察發現刮傷本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊先樂，許佳露，胡鯤，
申請(專利權)人：上海海洋大學，
類型：發明
國別省市：