本發明專利技術提供了一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記，其包括15個尾葉紫薇的微衛星位點。本發明專利技術還提供了該尾葉紫薇微衛星DNA分子標記的篩選方法及其在尾葉紫薇遺傳多樣性研究中的應用。此外，本發明專利技術還提供了擴增該15個尾葉紫薇微衛星位點的引物序列和擴增方法，建立了尾葉紫薇的微衛星DNA分子標記技術體系，并利用這些標記進行尾葉紫薇遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助育種，重復性好，是一種可靠有效的DNA分子標記。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及DNA分子標記技術，具體地說，涉及一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記及其應用。
技術介紹
尾葉紫薇(Lagerstroemia caudata),屬千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬落葉大喬木，高18 30米，胸徑約40厘米；樹皮光滑，褐色，成片狀剝落；全株無毛；花期4-5月，果期7-10月。尾葉紫薇開花繁密，香味濃郁，是培育芳香紫薇品種的優良親本。其在石灰巖石山稍蔭蔽的山坡上生長良好，萌蘗力較強，是石灰巖石山優良綠化樹種之一。同時，尾葉紫薇木材堅硬、紋理細致，淡黃色，適于作上等家俱、室內裝修、細工或雕刻等用材。尾葉紫薇原產于我國，已被列為瀕危植物(《中國物種紅色名錄》第一卷，高等教育出版社，2004)。目前僅有關于尾葉紫薇單一種群結構的研究(黃晨暉等，2008，尾葉紫薇種群結構和動態的初步研究，熱帶林業，36 (4)，24 26)，而關于尾葉紫薇資源分布、種群遺傳多樣性和種質資源保護等方面的研究尚未見報道。簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR)，也稱微衛星DNA (microsatellite)，是一種由2 5個核苷酸為單位多次串聯重復的長達幾十甚至幾百個核苷酸的序列。這些序列廣泛存在于真核生物基因組的不同座位上，每個座位重復單位的數量可能不完全相同，因而形成多態性。由于其具有多態性豐富、重復性高、共顯性遺傳等優點，被廣泛應用于植物的群體和進化遺傳研究、種質資源遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建等領域。因此，開發尾葉紫薇微衛星標記，利用其研究尾葉紫薇資源遺傳多樣性和種群結構，對尾葉紫薇種質資源的保護和利用具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記。本專利技術的另一目的是提供上述DNA分子標記的篩選方法。本專利技術更進一步的目的是提供上述DNA分子標記在尾葉紫薇遺傳多樣性研究中的應用。為了實現本專利技術目的，本專利技術的一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記，其中擴增所述分子標記的引物為如下引物對12HF : 5' -AAAGACGCAGAAGGATGG-3'I2HR:5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'前述的DNA分子標記，其編號為I2H的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNo. 4所示。本專利技術的一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記的篩選方法，其包括以下步驟(I)提取尾葉紫薇基因組DNA，用內切酶Rsa I進行酶切，得到大小為300 IOOObp 的 DNA 片段;(2)將寡核苷酸 SuperSNX24F (5 ’ -GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3 ’)和末端磷酸化的 SuperSNX24R(5’ -pGAITCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA-3’ )等摩爾混合，形成接頭；(3)將步驟(2)的接頭與步驟(I)的酶切產物連接；(4)以SuperSNX24F為引物，步驟(3)的連接產物為模板，進行PCR反應，富集大小為300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3’ Biotin標記的探針20種，將其按照要求等體積混合(所有探針濃度均為100 u M)，將混合好的探針稀釋100倍待用；(6)將步驟(4)的DNA片段分別與步驟(5)三組探針進行雜交；(7)向雜交后的溶液中加入磁珠，洗滌磁珠；(8)向洗滌后的磁珠中加入TE，得到含有微衛星DNA片段的上清液；(9)以SuperSNX24F為引物，步驟(7)的上清液為模板，進行PCR反應，得到目的片段；(10)將步驟⑶的擴增產物轉化至大腸桿菌中，篩選轉化子，進行PCR擴增，對產物大小為500 1200bp的菌液進行測序，得到50個微衛星序列，其中包含微衛星位點60個；(11)根據微衛星位點兩端的側翼序列設計引物并以8株尾葉紫薇個體基因組DNA為模板進行SSR-PCR擴增，得到尾葉紫薇微衛星標記15個，其編號分別為I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A，其核苷酸序列如 SEQID No. I 至 SEQ ID No. 15 所示。利用本專利技術的尾葉紫薇微衛星DNA分子標記分析尾葉紫薇個體間的遺傳學差異，具體分析方法為(I)分別對 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A位點的特異性引物的正向引物的5’端進行6-FAM或JOE標記；(2)提取尾葉紫薇不同個體的基因組DNA ；(3)分別用標記后的 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A位點的特異性引物，擴增20株尾葉紫薇的基因組DNA。所述特異性引物的序列分別為IlGF :5' -joeGTCACAGGTTACCGAATC-3'IlGR :5' -ATGTAAATGGTGAGGAGG-3'I2BF =5' -6_famTTCTTGTCTTGGGTATCGC-3 ' 12BR : 5' -GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3'12GF : 5' -J0ETTCTTCCACTTCCTCCTT-3' 12GR : 5' -CAGCCCACATTAACTTTT-3'12HF : 5' -6_famAAAGACGCAGAAGGATGG-3 '12HR : 5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'13GF : 5' -6_famATGTGGTGAATGGGAACT_3 '13GR : 5' -TTGGGCTAAAGATATGGA-3'I9HF:5' -6_famGGACCAGATTGTAAATGC-3 '19HR : 5' -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3'IlOHF :5' -joeATTCGATCTGCCCTCTTG-3'IlOHR :5' -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3'112HF : 5'-讓TCCCTTTAACGAGGAATG-3' 112HR : 5' -AAGTTTCTCGACGGCTTT-3'IIlCF :5' -joeGTGCTGGAGGAACTGCTA-3'IIlCR :5' -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3'II2CF :5'-讓TTTGGTGGTAGTGGGAGT-3'II2CR :5' -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3'II3AF :5' -6-famCCTAACAAGAAAGGAACAG_3'II3AR :5' -TTTCAGGACATCAGCACC-3'II3HF :5' -joeCCTCCTCCTGCCACTCCTCT-3'II3HR :5' -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3'II6AF :5' -6_famAGTTACTTATCTCCGCATTC_3'II6AR :5' -GACCATTTTACCCTTTCA-3'II8AF :5' -J0EAAGATATGCTGTTGAGTTT-3'II8AR :5' -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3'II12AF:5,-讓 CAACAGTAAAATTGGAG本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張啟翔，蔡明，潘會堂，王學鳳，孫明，高亦珂，程堂仁，宋平，田苗，
申請(專利權)人：北京林業大學，
類型：發明
國別省市：
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