提供了用于基因治療的表達載體，其含有轉錄調控元件的新組合，包括啟動子、增強子、內含子、非翻譯區(UTR)和基因座控制區(LCR)。所述表達載體能夠持續表達肝組織特異性基因，因而能有效地用于治療血栓形成、血友病、肝癌等等。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及用于基因治療的表達載體，更特別地涉及包含轉錄調控元件(順式調控元件或者反式作用元件)新組合的用于基因治療的表達載體，其包括啟動子、增強子、內含子、非翻譯區(UTR)和基因座控制區(locus control region, LCR),所述載體能夠支持靶基因在肝中以高水平持續表達。
技術介紹
肝的功能包括血液儲存、糖轉換和分泌多種細胞因子，以及表達影響許多疾病(如遺傳的、心血管的、代謝的、血液的和癌性疾病)的基因。已將多種肝特異性疾病(如感染性肝炎)作為基因治療的靶標進行了研究。肝細胞在形成后擁有很長的壽命，具有大多數病毒基因轉運蛋白的受體而且直接與血流相連，使其易于接觸藥物，因此肝被認為是基因治療的重要候選器官。血友病是一種由位于X染色體上的因子VIII(FVIII、f8)或因子IX(FIX、f9)基因的缺陷所引起的退行性出血疾病，依據突變或缺失的基因將其分成血友病A(FVIII缺陷)或B (FIX缺陷)。對用于治療血友病A或B的藥物，只有當FVIII或FIX以其正常血液濃度的1-5% (分別為100-200ng/ml和500ng/ml)或更高水平持續表達時，治療效果才是可預期的。在最近的血友病B基因治療研究中，已報道的是，將帶有人FIX (hFIX)基因的腺相關病毒(AAV)引入血友病B小鼠模型中導致hFIX蛋白以高達1，500-1，800ng/ml的水平表達(Snyder, R. 0.，Nat. Med.，5 :64-70 (1999) ；Manno, C. S.，Nat. Med.，12 :342-347 (2006))，而在血友病B的狗模型中以高達730ng/ml的水平表達hFIX蛋白(Arruda，V. R.，Blood,105:3458-3464(2005))。然而，當將這種在動物模型中高效表達的載體臨床應用于人患者時，FIX的血液濃度僅為185ng/ml或更低，這低于有效臨床治療的閾值(500ng/ml)，另外的難題是在人受試者中的hFIX表達水平不是持續的而是瞬時的(Kay，M. A. ,Nat. Genet. ,24 257-261 (2000) ；Manno,C. S. ,Nat. Med. , 12 :342-347 (2006))。在血友病 A 的治療模型中發現了與上述相似的趨勢。針對遺傳疾病(如血友病)治療的臨床試驗結果表明，首要條件是開發能夠保持在特定組織(如肝組織)中持續高水平表達治療基因的高效組織特異性表達載體。此外，逃脫針對載體的體液及細胞免疫應答以及誘導對所表達蛋白的免疫耐受被認為是成功的基因治療的關鍵因素。例如，為了將正常FVIII或FIX的表達水平提高到有效用于成功的臨床治療的閾值，還必須考慮的是，注射高劑量的帶有FVIII或FIX基因的病毒并且抑制體內的免疫應答。然而為使這種方法獲得成功，首先要通過改進表達載體來提高基因表達的效率。僅在肝中產生的脂蛋白(a)是用于肝組織特異性表達載體開發的另一個重要靶標。脂蛋白(a)是通過載脂蛋白(a)(—種糖蛋白)與apo B_100(低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白質組分)結合而形成的(Fless，G.M.，J. Biol. Chem. ,261 :8712-8717 (1986))。載脂蛋白(a)負責膽固醇的體內轉運，已報道血漿中脂蛋白(a)濃度的提高是動脈硬化和心臟病的主要風險因子(Armstrong, V. W.等，Arteriosclerosis, 62 :249-257 (1986)；Assmann, G.，Am. J. Cardiol. ,77 :1179-1184(1996))。載脂蛋白(a)含有與纖維蛋白溶酶原kringle IV和V相似的兩類kringle結構域，以及無活性的蛋白酶樣結構域。眾所周知的是，具有kringle結構的蛋白質可抑制腫瘤的新血管形成及轉移(Folkman J. , N EngJ Med,285 :1182-1186(1971) ；Falkman J, Klagsbrun M. ， Science，235 :442-447(1987)；Scapaticci FA. , J Clin Oncol.，20 :3906-3927 (2002))。最近，本專利技術人及其他研究者發現，載脂蛋白(a)的kringle結構域由于其顯著的抗血管發生活性而具有抗癌和抗轉移活性(Sculter V等，ArteriosclerThromb Vasc Biol,21 :433-438(2001) ；Trieu UN和UckunFM.，Biochem Biophys Res Commun.，257 :714-718(1999) ；Kim JS 等，J. BiolChem.，278 29000-29008(2003) ；Yu HK 等，Cancer Res. ,64 :7092-7098(2004) ；Kim JS 等，BiochemBiophys Res Commun. ,313 :534-540(2004) ；Lee K等，Hepatology,43 :1063-1073(2006))。在抗轉移和抗癌治療中，公認的是，選擇性作用在患病位點上的治療方式會更有效。因此，開發用于抗癌治療(例如用于對肝癌或者轉移肝腫瘤的有效基因治療)的能組織特異性地持續進行基因表達的載體非常重要。如上所述，持續的組織特異性基因表達是有效基因治療的關鍵，這需要開發新的改良表達載體。這可通過改進這種表達載體的轉錄調控元件(順式調控元件或反式作用元件)來實現。常用轉錄調控元件的實例包括啟動子、增強子、內含子、非編碼區、基因座控制區坐坐寸寸O在這種肝組織特異性表達的表達載體中所使用的是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK，為糖原異生酶)(Yang, Y. ff.，J.等，Gene Med. ,5(5) :417-424 (2003))、a I-抗胰蛋白酶、白蛋白、FVII、有機陰離子轉運多肽C(OATP-C)、乙型肝炎病毒核心蛋白(Kramer，M.G.，等，Mol. Ther. ,7(3) :375-385(2003))和甲狀腺素結合球蛋白(Wang, L.，等，Proc.Natl. Acad. Sci.，96 :3906-3910 (1999))的啟動子；以及白蛋白(Kang, Y.，等，Blood,106(5) =1552-1558 (2005))、苯丙氨酸羥化酶(PAH)和a I-微球蛋白/尿抑胰酶素(bikunin)前體(AMBP) (Wang, L.，等 ，Mol. Ther.，I (2) :154-158(2000))的增強子。由于與肝中所富含的HNF_4(肝細胞核因子-4)結合，FVII啟動子(大小約為500bp)在肝中的轉錄活化水平是其他組織中的10倍或更高。已報道的是，大多數轉錄因子主要結合在 FVII 啟動子 3，端的 300bp 片段上(Greenberg, D.，等,Proc. Natl. Acad. Sci.，92 :12347-12351 (1995))。當截短FVII啟動子(大小為501bp)5’端的315bp片段時，啟動子的肝特異性活性提高約30%，但當截短210bp片段時活性本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：高垡經，李圭鉉，李賢，尹成泰，趙義哲，
申請(專利權)人：財團法人牧巖生命工學研究所，
類型：發明
國別省市：
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