一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因制造技術

本發明專利技術公開一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內脂肪沉積相關的脂聯素（Adiponectin）基因，基因的CDS序列全長為732bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列編碼243個氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。檢測Adiponectin基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達譜，結果顯示Adiponectin基因在脂肪組織中表達量最高，初步表明Adiponectin基因在脂肪細胞中調控脂肪沉積的功能。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及動物分子育種的基因工程技術，特別是一種與豬肌內脂肪沉積相關的脂聯素(Adiponectin)基因技術。
技術介紹
近年來，由于豬的選育工作中過度追求高瘦肉率，導致豬肉品質的嚴重下降。隨著生活水平的不斷提高，人們對豬肉顏色、嫩度、風味等肉品質特性的要求也越來越高。肌內脂肪(intramuscular fat, IMF)是影響肉品質的重要因素，目前已得到越來越多的認識和 重視。肌內脂肪的沉積是一個復雜的生理生化過程，主要涉及肌肉內甘油三酯的代謝，包括甘油三酯的合成、分解及轉運等過程。因此，肌內脂肪細胞內的脂類代謝是肌內脂肪沉積的基礎。隨著脂肪細胞分泌功能的發現，越來越多的證據指出，脂肪細胞分泌的生物活性物質不僅可以調節脂肪沉積，且對骨骼肌代謝有重要的調控作用，可望成為改善豬胴體品質的新突破口。其中脂聯素(Adiponectin)是新發現的一種脂肪細胞分泌因子，它以內分泌方式循環于血液中，具有調控機體能量穩衡、葡萄糖代謝和脂肪代謝等功能。在人、猴子、小鼠的研究中發現，Adiponectin可以降低血漿甘油三酯濃度，增強機體糖代謝，提高胰島素敏感性，刺激脂肪酸氧化，減少成熟脂肪細胞對脂肪的吸收，是目前已知的唯一對肥胖呈負調節的一種脂肪特異性蛋白。因此，體內Adiponectin基因的表達與脂肪沉積密切相關，可成為調控肌內脂肪沉積的候選基因。目前，對豬Adiponectin基因的序列及表達已有所報道。Wang等(2004)首次克隆了豬Adiponectin基因片段，并發現其在豬脂肪組織中高度表達。Jacobi等(2004)也報道了豬Adiponectin的基因全長為732 bp，編碼243個氨基酸。雖然在Adiponectin對機體脂肪沉積和肌肉代謝調節方面的研究取得了一些進展，但Adiponectin基因的表達如何調控豬脂肪沉積和肌肉代謝的確切作用及其機理，國內外迄今尚未見報道。豬是脂肪沉積型動物，其脂肪沉積能力在不同品種之間變化很大。我國一些肉質優良的地方豬種是最寶貴和稀缺的基因資源，這在優質豬肉的培育中有獨特的利用價值。版納微型豬是云南省優良的地方豬種，具有耐粗飼、適應性強、肉質優良、肌內脂肪豐富，肌纖維細密，肉質鮮嫩等優良特性。然而，目前對版納微型豬的生長發育及肌內脂肪沉積的分子機制知之甚少。近年來，本課題組采用基因芯片技術和生物信息學分析方法，在對豬肌肉組織和肌內脂肪細胞基因表達譜的研究中發現Adiponectin基因參與肌內脂肪細胞的脂類代謝過程，并首次從版納微型豬肌肉組織中克隆了 Adiponectin基因。因此，研究版納微型豬Adiponectin基因的序列與表達模式,分析其核苷酸和氨基酸序列結構特點，從分子水平了解版納微型豬肌內脂肪沉積較多的特點，為進一步研究該基因的功能及為改善豬胴體脂肪性狀的育種工作提供理論基礎
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，采用基因芯片技術和生物信息學分析方法，在對豬肌肉組織和肌內脂肪細胞基因表達譜的研究中發現Adiponectin基因參與肌內脂肪細胞脂類代謝過程，并首次從版納微型豬肌肉組織中克隆了 Adiponectin 基因。一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內脂肪沉積相關的脂聯素(Adiponectin)基因，基因的⑶S序列全長為732bp，其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I。并且，CDS核苷酸序列編碼243個氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。對上述特征的肌內脂肪沉積Adiponectin基因設計引物，進行PCR擴增，檢測Adiponectin基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達譜，結果顯示Adiponectin基因在脂肪組織中表達量最高,初步表明Adiponectin基因在脂肪細胞中調控脂肪沉積的功能。Adiponectin是脂肪細胞的特征性基因，與肌肉組織中肌內脂肪沉積有關。本專利技術克隆得到版納微型豬Adiponectin基因⑶S全序列,全長為732bp,提交到Genbank,登錄號為JN634961。與Genbank提供的豬Adiponectin基因相比較，沒有發現核苷酸突變位點，因 而也無氨基酸突變位點。Adiponectin蛋白在物種間的同源性較高,通過進化樹可以看出，豬與人的親緣性較近，其次是牛、小鼠、大鼠。豬Adiponectin蛋白氨基酸序列與牛、人、小鼠和大鼠的同源性分別為84%、83%、81%和80%。Adiponectin蛋白在不同物種間的高度保守性提示它們功能的重要性，這些基因的保守性也是Adiponectin在各個物種中相應的生理特點保持不變的分子基礎。另外，Adiponectin在脂肪組織中的高度表達，也證明了它在肌內脂肪沉積等方面的重要作用。附圖說明圖I是本專利技術的PCR擴增Adiponectin基因圖示 圖2是本專利技術的Adiponecin在不同組織中的表達水平柱圖 圖3是本專利技術的Adiponectin基因酶切鑒定圖 圖4是本專利技術的進化樹分析圖 圖5是本專利技術的Adiponectin蛋白二級結構預測圖 圖6是本專利技術的Adiponectin蛋白磷酸化位點預測圖 圖7是本專利技術的Adiponectin蛋白糖基化位點預測圖 圖8是本專利技術的Adiponectin蛋白疏水性分析圖 圖9是本專利技術的Adiponectin蛋白的信號肽預測圖具體實施例方式一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內脂肪沉積相關的脂聯素(Adiponectin)基因，其特征在于基因的CDS序列全長為732bp,其⑶S核苷酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. I。并且，⑶S核苷酸序列編碼243個氨基酸，氨基酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2。對上述特征的肌內脂肪沉積Adiponectin基因設計引物，進行PCR擴增，檢測Adiponectin基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達譜，結果顯示Adiponectin基因在脂肪組織中表達量最高,初步表明Adiponectin基因在脂肪細胞中調控脂肪沉積的功能。具體為 I、肌肉組織中總RNA的提取 采取50kg成年版納微型豬肌肉組織立即放入液氮中保存備用。利用RNA提取試劑提取版納微型豬肌肉組織總RNA，具體操作參照試劑盒說明進行。將提取的RNA反轉錄成cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物設計及PCR反應條件 根據 GenBank 中豬 Adiponectin 序列信息(GenBank 登錄號 EF601160. 1)，利用 PrimerPremier 5.0設計引物,并合成。用于克隆的Adiponectin基因的引物序列為F :5，- GTCTGTGGCTCTGATTCCA -3，R:5’ - TCATTCAATGTTGTGGTAGAGA -3’ 用于突光定量的Adiponectin基因的引物序列為F :5，- GGCTCTGTGCTCCTCTATCT -3，R:5’ - TTGGCAGTGCTCATCATTC -3’ 內參1本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：高士爭，潘洪彬，黃英，趙素梅，王靜，王聰，劉維全，朱寶利，
申請(專利權)人：云南農業大學，
類型：發明
國別省市：