一種蟬擬青霉菌株的鑒定方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo.3453的方法，包括下列步驟：提取待檢菌株的DNA；對待檢菌株DNA分別采用引物S6、S10、S31、OPV-14和OPW-06進(jìn)行PCR擴(kuò)增：獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得待檢菌株的RAPD條帶圖譜；將獲得的待檢菌株的RAPD條帶圖譜與標(biāo)準(zhǔn)樣本的RAPD條帶圖譜比較判定獲得鑒定結(jié)果。采用本發(fā)明專利技術(shù)的鑒定方法，可快速、準(zhǔn)確地鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo.3453，并且不受環(huán)境影響。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利涉及分子生物學(xué)
，具體涉及保藏號為CGMCC No. 3453的蟬擬青霉菌株的鑒定方法。
技術(shù)介紹
蟬花，別名蟲花，是某些蟬若蟲受蟬擬青霉菌寄生后的產(chǎn)物，是ー種菌蟲復(fù)合體。此菌于1838年由Miquel定名為蝶棒束孢霉Isaria cicadae。此后出現(xiàn)多種同物異名。如蝶卓 Cordyceps cicadae,基生_束抱 Isaria basiIi,羊克糴球殼抱 Sphaeria sinclairii, 叢生蟲殼菌Torrubia caespitosa,辛克萊蟲草Cordyceps sinclairii,哈里棒束抱Isariahariottii,小蝶鸞Cordyceps sobolifera,辛克萊棒束抱 Isaria sinclairii,蒙克蘇棒束抱 Isaria mokanshawii 和多枝棒束抱 Isaria arbuscula 等等。蝶擬青霉的有性階段被認(rèn)為是大蝶草Cordyceps cicadae,在自然界廣為分布的是蟬擬青霉，大蟬草稀少。常采到的是蟬擬青霉及其寄主山蟬若蟲寄生后的復(fù)合體。根據(jù)歷史產(chǎn)區(qū)浙江的1467份樣品的調(diào)查，藥材蟬花主要是蟬擬青霉寄生后的蟲菌復(fù)合體。蟬擬青霉屬半知菌類真菌，其孢梗束自蟲體頭部長出，單生或叢聚成束，淺黃色，長I. 5 8. O厘米，前端膨大，呈紡錘形或呈雞冠花狀。本專利技術(shù)所涉及的蝶擬青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]已于2009年11月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)注冊保藏，保藏號為 CGMCC No. 3453。該蝶擬青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]采用如下方法進(jìn)行分離從云南三江源頭采集純凈無污染野生蟬花標(biāo)本，在浄化工作臺上用火焰滅菌過的移植鑷從樣本上取少量分生孢子于加入孟加拉紅的PSA平板上置22°C -25°C下培養(yǎng)120h后再挑取單菌落接入斜面培養(yǎng)基，在22°C _25°C下培養(yǎng)并經(jīng)反復(fù)純化即可得本專利技術(shù)所述的蟲單擬青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]。蝶擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCC No. 3453 屬于半知菌亞門Deuteromycotina,絲抱綱Hyphomycetes,束梗抱目Stilbellales,束梗抱科Stilbellaceae,擬青霉屬Paecilomyces。其主要形態(tài)特征為在PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)10天，菌落圓形，平展，初絮狀，后粉狀，白色至淺黃色，背面淺黃色，直徑5 6厘米。菌絲無色，分枝，具隔膜，寬I. 2 2.5 μ m。分生孢子梗多分枝，寬3. O 5. 5 μ m，由每輪2 5個產(chǎn)孢細(xì)胞組成輪狀分枝。產(chǎn)孢細(xì)胞瓶形，基部球狀膨大，向上變細(xì)窄，4. 5 6. 5 X 2. 5 3. 5 μ m。分生孢子圓柱形，單細(xì)胞，無色，平滑，鏈生，直或彎曲，6. 5 8. 8( 11. O) X2. 5 3. 5 μ m。蝶擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCC No. 3453 經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)其培養(yǎng)物具有易于培養(yǎng)、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，其培養(yǎng)產(chǎn)物具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血月旨、降血壓、明目、抗輻射、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、改善腎功能等功能，因此具有廣泛的エ業(yè)化應(yīng)用價值。由于地理來源不同、寄主不同的蟬擬青霉菌株，其次生代謝產(chǎn)物方面具有較大的變異性。但是現(xiàn)有的蟬擬青霉鑒定方法是通過菌體形態(tài)，生長特性及生理反應(yīng)的特征進(jìn)行鑒定的，這些形態(tài)學(xué)鑒定的方法受環(huán)境因素影響，難以對形態(tài)差異較小的種間和種內(nèi)菌株加以鑒別。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種利用RAPD (random amplified polymorphic DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記)技術(shù)鑒定蝶擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCCNo. 3453的方法，以及特定引物和反應(yīng)條件下蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的RAPD條帶圖-i'Tfe レ曰。本專利技術(shù)公開了一種鑒定 !單擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae (Miq. ) SamsonCGMCCNo. 3453的方法，包括下列步驟I)提取待檢菌株的DNA ；2)對步驟I)獲得的待檢菌株DNA分別采用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增S6 TGCTCTGCCC ；SlO CTGCTGGGAC ；S31 CAATCGCCTG ；OPV-14 AGATCCCGCC ；0PW-06 AGGCCCGATG ；3)將步驟2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得待檢菌株的RAH)條帶圖譜；4)將步驟3)獲得的待檢菌株的RAPD條帶圖譜與標(biāo)準(zhǔn)樣本的RAPD條帶圖譜比較判定獲得鑒定結(jié)果。進(jìn)ー步的，步驟2)的引物還包括以下引物中的ー種或多種S7 GGTGACGCAG ；S33 CAGCACCCAC ；S69 CTCACCGTCC ；0PC-10 TGTCTGGGTG ；0PF-06 GGGAATTCGG ；0PG-03 GAGCCCTCCA ；OPH-18 GAATCGGCCA ；0PH-20 :GGGAGACATC。進(jìn)ー步的，所述步驟2)所采用的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下總體積25ul，DNA樣本20-50ng,Mg2+ 50n mol,dNTP 5n mol，引物IOp mol，Taq 酶1. 5U (如 TAKARA Ex Taq)，酶反應(yīng)緩沖液2. 5ul (如TAKARA Ex Taq Buffer)，加雙蒸水至25ul。進(jìn)ー步的，所述步驟2)所采用的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下先95°C 3分鐘；而后依次95°C 40秒，560C I分鐘，72°C 2分鐘，共循環(huán)40次；然后72°C延伸5分鐘，最后降溫至4で。進(jìn)ー步的，所述步驟4)中，將步驟3)獲得的待檢菌株RAH)條帶圖譜與標(biāo)準(zhǔn)樣本的RAPD條帶圖譜比較，如兩者相似度為95%以上，則鑒定待檢菌株為蟬擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae(Miq. ) Samson CGMCC No. 3453。所述相似度的計(jì)算方法為F = 2NXY/(Νχ+Νγ)*100% (其中F為相似度，Nxy為待檢菌株RAPD條帶圖譜與標(biāo)準(zhǔn)樣本的RAPD條帶圖譜比較后二者相同的條帶數(shù)，Nx為待檢菌株RAPD條帶圖譜擁有的條帶數(shù)，Ny為標(biāo)準(zhǔn)樣本的RAPD條帶圖譜擁有的條帶數(shù))。采用本專利技術(shù)的鑒定方法，可快速、準(zhǔn)確地鑒定蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453，并且不受環(huán)境影響。附圖說明圖I :各引物對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣本的RAPD條帶圖譜I :S6為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是:23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，IOOObp,900bp,800bp,700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 6500 6000bp 之間，5500 4700bp 之間，260本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種鑒定蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的方法，包括下列步驟 1)提取待檢菌株的DNA； 2)對步驟I)獲得的待檢菌株DNA分別采用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增56TGCTCTGCCC ；SlO CTGCTGGGAC ；S31 CAATCGCCTG ；OPV-14 AGATCCCGCC ；0PW-06 AGGCCCGATG ； 3)將步驟2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得待檢菌株的RAH)條帶圖譜； 4)將步驟3)獲得的待檢菌株的RAH)條帶圖譜與標(biāo)準(zhǔn)樣本的RAH)條帶圖譜比較判定獲得鑒定結(jié)果。2.如權(quán)利要求I所述鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，步驟2)的引物還包括下列引物中的ー種或多種57GGTGACGCAG ；S33 CAGCACCCAC ；S69 CTCACCGTCC ；0PC-10 TGTCTGGGTG ；0PF-06 GGGAATTCGG ；0PG-03 GAGCCCTCCA ；OPH-18 GAATCGGCCA ；0PH-20 :GGGAGACATC。3.如權(quán)利要求I所述鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述步驟2)所采用的PCR擴(kuò)增反...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：魏寧，鮑曉妮，江三多，張健，陳超，孫長勝，
申請(專利權(quán))人：上海泛亞生命科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：