本發明專利技術屬于分子生物學和醫學領域。本發明專利技術提供了一種預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿miRNA譜及檢測試劑盒，該miRNA譜包括SEQIDNO1-11中一個或多個miRNA。同時提供了相應的、高效、低廉的試劑盒和檢測芯片以及檢測方法。本發明專利技術檢測血漿、血清中miRNA水平，適合應用于臨床判斷干擾素治療的有效性。與其他已知與療效相關因素相比，此表達譜是一個獨立的預測因素。將此預測譜與病人治療前ALT水平結合可獲得更高的預測準確率。此表達譜與HBV耐藥突變分析結合將有助于個體化治療方案的開展，最終降低治療費用并提高完全應答的比例。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學和醫學領域。更具體地，涉及血漿miRNA表達水平預測干擾素治療慢性乙肝療效。本專利技術還涉及檢測miRNA水平的方法和試劑盒。
技術介紹
乙型肝炎病毒(HBV)感染能引起慢性肝臟疾病并顯著增加罹患肝細胞癌的風險。 雖然已廣泛使用乙肝表面抗原重組抗原疫苗預防感染，HBV感染仍然是世界各國的重要健康問題。干擾素α與核苷類似物，如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡維、替比夫定等是HBV感染的主要治療藥物。干擾素治療通常只能在有限的病人中獲得完全應答，中止治療后容易復發。近年來應用聚乙二醇化干擾素(又稱長效干擾素，主要有PEG-IFNa 2a，PEG-IFNa 2b兩種)顯著提高了 e抗原血清轉換(PEG-IFNa 2a 32%，PEG-IFN a 2b 36%)和一小部分病人表面抗原血清轉換(2. 9%，PEG-IFNa 2a)。然而，長效干擾素容易引發如流感樣癥狀、抑郁、性格改變等副作用。核苷類似物，如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡維、替比夫定等，是乙肝逆轉錄聚合酶的有效抑制劑，能阻斷病毒基因組復制。但是，這類藥物治療不能獲得較高的血清轉換率，且有很大一部分病人在停止用藥后復發。另外，長期使用容易引起耐藥突變的形成。盡管近些年在慢性乙肝的治療手段、病毒血清轉換率和病毒學應答方面都有了顯著提高，慢性乙肝的治療效果仍不夠理想。特別是長效干擾素對于發展中國家的低收入家庭非常昂貴。因此，目前急需能夠在治療前預測干擾素治療效果的方法，從而為個人化治療提供解決方案。目前已知的與治療預后相關的因素有I.治療前ALT水平，2.治療前HBVDNA, 3.性別，4.肝臟組織學狀態，5.治療過程中HBsAg低度變化動態。然而，目前的指標的預測能力有限，急需一種能在血液中中檢測的，有較高預測準確度的分子標記。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是確定一種能在血液中中檢測的，有較高預測準確度的分子標記。近年來的研究顯示小非編碼RNA(約22和核苷酸)，又稱小RNA(microRNA，miRNA)。小RNA存在于各類組織中，能通過與靶mRNA3’未翻譯末端核苷酸配對促進其降解或抑制翻譯。miRNA是由長前體RNA進行轉錄產生，并被Drosha (—種核酸酶)預處理后通過exportin-5介導的出核過程轉運到細胞漿。miRNA進一步被DICER酶剪切，最后形成17-24個核苷酸的成熟miRNA，并與RISC復合體結合，執行基因沉默功能。小RNA是一類在血漿中存在的短核苷酸，已有報道證明可以作為肝臟損傷和妊娠的非常敏感的分子標記。本專利技術經過大量研究，確定了一種預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿miRNA譜，該miRNA譜包括SEQ ID NO 1_11中一個或多個miRNA。并且，根據該miRNA譜提供了一種預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的試劑盒，該試劑盒含有針對SEQ ID NO 1-11中一個或多個miRNA特異性探針核苷酸。同時，提供了一種預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的芯片，該芯片含有針對SEQID NO 1-11中一個或多個miRNA特異性探針核苷酸。本專利技術還提供了一種預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的方法，即檢測SEQ IDNO 1-11中一個或多個miRNA在使用干擾素前血漿、血清樣品中表達水平，對樣品中表達水平與標準水平差異利用統計方法分析預測干擾素療效。所述miRNA中至少一種的表達水平高于或者低于已知的標準水平。 具體的，該方法包括步驟(I)血漿、血清樣本小RNA的抽提，(2) 核酸樣本與具有如SEQ ID No. 1-11中一個或多個miRNA特異性探針的芯片進行雜交，(3)對雜交信號與對照樣本的雜交結果進行比較。所述的統計方法是分析樣品中表達水平與標準水平差異的顯著性。所述的統計方法包括miRNA表達譜通過最大關聯度最小冗余度分析對每個miRNA評分；利用近鄰分類算法作為預測引擎進行類別判斷；特征值遞增分析法和留一法交叉驗證優化入選miRNA的數量。本專利技術中，乙肝病人治療前部分miRNA的表達譜能夠預測干擾素α治療效果，并據此公開了相關miRNA的檢測方法、預測模型建立的方法及檢測試劑盒。本專利技術提供了一個獨特的能夠區分HBV患者是否對長效干擾素或普通干擾素治療應答(初期病毒學應答，治療12周大于21og HBVDNA降低)的miRNA表達譜。此表達譜由 hsa-let-7a SEQID NO. 1/11，hsa_miR-30a SEQID NO. 2/11, hsa-miR-1290 SEQIDNO. 3/11, hsa-miR-106b SEQID NO. 4/11, hsa-miR-1224_5p SEQID NO. 5/11, hsa-miR-939SEQID NO.6/11, hsa-miR-1281 SEQID NO.7/11, hsa-miR-198 SEQID NO.8/11,hsa-let-7f SEQID NO. 9/11, hsa-miR-22 SEQID NO. 10/11, hsa-miR-638 SEQID N011/11組成。本專利技術提供了血清miRNA表達譜的檢測方法，具體而言，該方法包括步驟，(I)抽提血漿總RNA，(2)利用微陣列結束檢測總RNA中特定miRNA的表達譜?？梢园凑毡绢I域的常規方法操作。所述的統計方法使用logistic回歸分析結合miRNA SVM預測模型進行類別判斷。所述的統計方法包括下列各項中的一個或者幾個(l)miRNA表達譜通過OneR方法對每個miRNA評分，(2)支持向量機(Support Vector Machine)作為預測引擎進行類別判斷，(3)特征值遞增分析法(IFS)和留一法交叉驗證優化入選miRNA的數量。利用本專利技術的miRNA表達譜分析了 66例接受長效干擾素治療的HBV患者樣本，其敏感度為73. 3%和特異度75%。此miRNA譜由11個特異的核苷酸序列組成，其表達在無應答和快速應答組中有顯著差異。本專利技術進一步在28例接受普通干擾素治療的HBV患者中驗證了此預測模型，并取得71. 4%的準確度。 本專利技術提供了一種miRNA表達譜，能夠以較高準確度預測預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效。與其他已知與療效相關因素相比，此表達譜是一個獨立的預測因素。此表達譜與HBV耐藥突變分析結合將有助于個體化治療方案的開展，最終降低治療費用并提高完全應答的比例。相應的檢測方法方便、快速，成本較低。本專利技術同時還提供了高效、低廉的相應的檢測試劑盒和芯片。附圖說明圖I.優化能夠預測干擾素療效的miRNA譜流程圖。圖2.干擾素療效預測的IFS(遞增特征值)曲線圖。X軸，特征值的數量，Y軸，去一交互檢驗準確度。在選取10個特征值時到達準確度達到最高。圖3. A.各臨床參數與miRNA預測系統的優勢比；B.單獨miRNA模型(上圖)和加入ALT后(下圖)logistic回歸模型的分類圖。 具體實施例方式實施例I :miRNA表達譜的檢測 一·實驗材料 本專利技術從94例接受長效干擾素和普通干擾素的慢性乙肝患者中獲得血漿和血清樣本。本研究通過了倫理委員會的審核，所有病人都簽署了知情同意書。訓練集包括66例接受EG-IFN a 2a (180yg/周)或PE本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿miRNA譜，其特征在于，該miRNA譜包括SEQ ID NO 1-11中一個或多個miRNA。2.一種預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有針對SEQ ID NO 1-11中一個或多個miRNA特異性探針核苷酸。3.一種預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的芯片，其特征在于，該芯片含有針對SEQID NO 1-11中一個或多個miRNA特異性探針核苷酸。4.如權利要求3所述的芯片，其特征在于，該芯片含有針對SEQID NO 1_11的miRNA特異性探針核苷酸。5.一種預測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的方法，其特征在于，在使用干擾素前，檢測血漿、血清樣品中SEQ ID NO 1-11中一個或多個miRNA的表達水平，與治療前ALT水平比較，預測干擾素療效。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述miRNA中至少一種的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：袁正宏，張小楠，鄔敏，陳良，張繼明，張欣欣，張占卿，吳景迪，王介非，陳曉蓉，黃濤，
申請(專利權)人：上海市公共衛生臨床中心，
類型：發明
國別省市：
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