本發明專利技術涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應用。提供嗜水氣單胞菌適體以及所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法與應用。所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法的具體步驟包括：構建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫，并設計合成相應的引物；取適量所述ssDNA文庫與嗜水氣單胞菌進行結合；分離獲得與嗜水氣單胞菌結合的ssDNA，以該ssDNA為模板進行PCT擴增，擴增產物再次進行SELEX篩選直至獲得相應適體。本發明專利技術采用SELEX技術篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體可廣泛應用于嗜水氣單胞菌的檢測與分析。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及水產養殖中常見的致病病原菌一嗜水氣單胞菌，特別涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應用。
技術介紹
嗜水氣單胞菌(Aerotnoims hydrophila)在自然界分布廣泛，是多種水生動物的原發性致病菌，可產生多種致病因子，對水產動物，畜禽和人類均有致病性，可引起多種動物的敗血癥和人類腹瀉，給人類健康帶來了威脅，同時也給養殖業造成較大的經濟損失(I.張翠娟，于宙亮，趙寶華，何宏軒.嗜水氣單胞菌研究進展[J].中國獸醫雜志，2008，42(7) :46-50.)。因此，對于作為水源污染指示菌的嗜水氣單胞菌污染，其檢測力度仍需進一步加強。目前嗜水氣單胞菌的檢測一直是個棘手的問題，傳統的化學病理檢測過程繁瑣，耗 費時間；酶聯免疫、多重PCR技術則成本過高(2.王利.魚類嗜水氣單胞菌的幾種檢測方法[J].內陸水產，2006，(2):22-23.)。因此，開發一種操作簡便，成本低廉，快速方便的嗜水氣單胞菌檢測方法，成為本領域技術人員迫切需要解決的技術難題。SELEX ( Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)即指數富集配體系統進化技術，是1990年由美國的Tuerk和Gold創建的一種體外合成篩選寡核苷酸適體的化學組合技術(3.孟慶玲，陳創夫.SELEX技術及其應用前景[J].塔里木大學學報，2008，20 (3) :44-48. 4.廖世奇，劉巍，王黎.SELEX技術應用研究進展[J].甘肅醫藥，2009，(02) :96-97.)。由于適體具有特異性高、庫容量大、合成時間短(5.王聰艷，孫偉，李建國，等.SELEX技術應用研究進展[J].生物技術通報，2006，(SI) :232-236.)等優點，SELEX技術現在廣泛應用在疾病防控、藥物篩選、臨床診斷等不同的
，隨著技術的不斷創新與發展，逐漸產生了一些新的SELEX篩選方法，如導向SELEX技術、復合靶分子SELEX技術、基因組SELEX技術等新的研究手段(6.孟慶玲，陳創夫.SELEX技術及其應用前景[J].塔里木大學學報，2008，20 (3) :44-48.)。
技術實現思路
本專利技術的第一目的在于提供嗜水氣單胞菌適體。本專利技術的第二目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法。本專利技術的第三目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體在檢測述嗜水氣單胞菌中的應用。所述嗜水氣單胞菌適體的核酸序列如序列表中1-22號中的序列所示。所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法是將指數富集配體系統進化技術(即SELEX篩選)應用于嗜水氣單胞菌適體的篩選，所述SELEX篩選的具體步驟包括 O構建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫，并設計合成相應的引物； 2)取適量所述ssDNA文庫與嗜水氣單胞菌進行結合； 3)分離獲得與嗜水氣單胞菌結合的ssDNA，以該ssDNA為模板進行PCT擴增，擴增產物再次進行SELEX篩選直至獲得相應適體。在步驟I)中，所述 ssDNA 文庫可為5 ' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTCAA-N35-TT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3'。所述引物可為引物 I :5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；引物 II 5/ -GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'； 引物III 5/ -地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'； 引物IV 5/ -生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'。 在步驟3)中，所述SELEX篩選共進行12輪。本專利技術采用SELEX技術篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體為嗜水氣單胞菌的快速檢測技術的開發以及在水產病害控制方面的應用提供參考，可廣泛應用于嗜水氣單胞菌的檢測與分析。附圖說明圖I為PCR產物3%瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖I中，M為50bp DNA marker, 1、3、5、7、9、11、12 分別表示第 1、3、5、7、9、11、12 輪的 PCR 產物。圖2為適體與嗜水氣單胞菌結合的吸光度。在圖2中，橫坐標為篩選輪數，縱坐標為A450nm時的吸光度。圖3-圖5為本專利技術所篩選的核酸適體二級結構圖。圖3中的結構最小自由能為-7. 60千卡/摩，圖4中的結構最小自由能為I. 83千卡/摩，圖5中的結構最小自由能為-3. 11千卡/摩。具體實施例方式一、ssDNA文庫及引物的合成 參照文獻(7、劉豐偉，蘭小鵬.體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應用[D].福州福建醫科大學，2007.)中公開的方法，用于SELEX篩選的隨機ssDNA文庫和引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。所用文庫為5'-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA CAT GAG GCCCGG ATC-3'。所用引物分別為引物 I :5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；引物 II 5/ -GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'； 引物III 5/ -地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'； 引物IV 5/ -生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'。上述引物在合成后用分子生物學中常用的TE緩沖液(pH8. O)稀釋至濃度為10 μ mol, -20°c保存備用。二、實驗試劑及緩沖液制備 Dynabeads 鏈酶親和素磁珠 M-280 試劑盒、2 X Taq PCR MasterMix、50bp DNA LadderMarker、牛血清白蛋白(BSA)均購自廈門鷺隆生物技術有限公司，PCR膠回收純化試劑盒購自omega公司，抗地高辛堿性磷酸酶購自Roche公司，對硝基苯磷酸二鈉為Amresco公司產品。緩沖液參照參考文獻(劉豐偉，蘭小鵬.體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應用[D].福州福建醫科大學，2007.)配制。三、菌種嗜水氣單胞菌ASl. 1801購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。四、SELEX篩選 取一定量隨機ssDNA文庫(首輪篩選用量為600pmol，隨后每輪減少用量)，加入600 μ L選擇緩沖液稀釋ssDNA，于95°C變性5min，冷卻lOmin。加入30 μ L的嗜水氣單胞菌菌懸液(菌的數量約為I. 5Χ108個)，混勻置搖床室溫結合30min，15000r/min，4°C下離心lOmin。之后棄上清液，加入600 μ L選擇緩沖液重懸，如此重復洗滌3次，洗去未與嗜水氣單胞菌結合的ssDNA,結合了 ssDNA的嗜水氣單胞菌沉淀用100 μ L ddH20重懸,96°C加熱5min,離心后取上清為模板，用引物I、IV進行PCR擴增，獲得標記生物素的雙鏈DNA (dsDNA)，利用M-280磁珠通過生物素一鏈親和素之間的相互作用分離ssDNA，作為下一輪篩選的次級庫。依照上述方法，對次級庫再次進行SELEX篩選，先后進行12輪SELEX篩選。 五、各輪適體與嗜水氣單本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.嗜水氣單胞菌適體，其特征在于，其序列如序列表中1-22號所示。2.如權利要求I所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法采用SELEX篩選，所述SELEX篩選的步驟包括 .1)構建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫，并設計合成相應的引物； .2)取適量所述ssDNA文庫與嗜水氣單胞菌進行結合； .3)分離獲得與嗜水氣單胞菌結合的ssDNA，以該ssDNA為模板進行PCT擴增，擴增產物再次進行SELEX篩選直至獲得如權利要求I所述的適體。3.如權利要求2所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法，其特征在于在步驟I)中，所述ssDNA 文庫為5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA C...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李元躍，王雷，段博文，陳融斌，黎中寶，
申請(專利權)人：集美大學，
類型：發明
國別省市：
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