犬惡絲蟲核酸疫苗及其制備方法技術

本發明專利技術提供了一種犬惡絲蟲核酸疫苗，用于犬惡絲蟲病的預防和治療，同時還提供了該疫苗的制備方法，根據犬惡絲蟲保護性抗原基因序列的開放性閱讀框設計引物進行PCR，與克隆載體PMD18-T連接；將克隆所得的兩個保護性抗原基因分別插入到真核表達載體pVAX1，構建犬惡絲蟲核酸疫苗。選用了保護性抗原基因進行了核酸疫苗的研制，以獲得免疫保護。犬惡絲蟲核酸疫苗能引起機體較強的細胞免疫和體液免疫反應，從而可以達到預防犬惡絲蟲病的目的。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術提供了一種犬惡絲蟲核酸疫苗，用于犬惡絲蟲病的預防和治療，同時還提供了該疫苗的制備方法，屬于生物制品制備

技術介紹
犬惡絲蟲病是由犬惡絲蟲i遞 iiis)成蟲寄生于犬的右心室、肺動脈內，使患犬形成機械性栓塞，影響心肺功能，導致呼吸衰竭、循環和泌尿系統遭受嚴重損傷的寄生線蟲病。犬、貓科動物是本病的天然宿主，野生肉食動物、馬屬動物、海貍、猩猩、麝鼠、靈長類等偶見感染，還可以感染人類。該病雖經多年研究，迄今尚無理想的防治藥物以及預防和治療辦法。因此，利用獲得的免疫相關基因制備核酸疫苗以刺激機體產生的免疫應答的免疫干預可能是控制犬惡絲蟲病更合適的途徑
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種犬惡絲蟲核酸疫苗，是抗犬惡絲蟲的新型疫苗，對于犬惡絲蟲病的預防有明顯效果。本專利技術還提供了該疫苗的制備方法，適用于工業化生產。本專利技術公開的犬惡絲蟲的保護性抗原基因基因(命名為GSP1)，如SEQ ID NO. I所/Jn ο本專利技術所述保護性抗原基因的擴增引物，其特征在于FI : 5 ’ - GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3，，SI :5’ -CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3'本專利技術提供的犬惡絲蟲核酸疫苗，其特征在于將犬惡絲蟲保護性抗原基因插入到真核載體PVAX1，獲得了核酸疫苗pVAXl-GSPl。本專利技術公開的犬惡絲蟲核酸疫苗的制備工藝，包括以下步驟 根據犬惡絲蟲保護性抗原基因序列的開放性閱讀框設計引物進行PCR，與克隆載體PMD18-T 連接； 將克隆所得的兩個保護性抗原基因分別插入到真核表達載體PVAX1，構建犬惡絲蟲核酸疫苗； 將構建的核酸疫苗分別轉染Hela細胞，經轉染細胞的間接免疫熒光、SDS-PAGE電泳、以及Western blot進行表達產物分析，并對免疫小鼠進行特異性抗體效價以及⑶4+和⑶8+ T淋巴細胞數量的檢測以驗證其免疫效果。本專利技術積極效果在于選用了保護性抗原基因進行了核酸疫苗的研制，以獲得免疫保護。犬惡絲蟲核酸疫苗能引起機體較強的細胞免疫和體液免疫反應，從而可以達到預防犬惡絲蟲病的目的。附圖說明 圖I :重組質粒PVAXl-GSPl的酶切鑒定圖；圖2 :轉染細胞的間接免疫熒光； 圖3 pVAXl- GSPl轉染Hela細胞表達產物Western Blot分析； 圖4 :重組蛋白疫苗免疫小鼠血清特異性抗體IgG抗體效價測定。具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本專利技術。本領域技術人員可以理解至IJ，在不背離本專利技術的精神和原則的前提下，對本專利技術的任何平行改變和改動都將落入本專利技術的待批權利要求范圍內。 實施例I : 犬惡絲蟲核酸的制備 本專利技術以犬惡絲蟲免疫相關基因GSPl為例，進行真核表達載體的構建。犬惡絲蟲核酸疫苗的制備步驟如下 I、參照GSPl基因序列開放性閱讀框及真核表達載體pVAXl圖譜設計引物并引入酶切位點。根據目的基因序列，設計兩對引物用來擴增GPSl片段 Fl :5’ - GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3’，下劃線為 BamH I 酶切位點。SI :5’ -CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3’，下劃線為 Xho I 酶切位點。2、以制備的含有GPSl插入片段的噬菌體基因組為模板擴增。PCR反應條件(95°C預變性 5min ;94°C變性 2min，57°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，30 個循環，72°C延伸 lOmin)，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將PCR純化產物克隆分別至PMD18-T載體，經PCR及相對應的酶切鑒定后，送生物公司測序鑒定，結果與(附篩選的免疫相關GSPl基因序列)相同。3、凝膠回收各個目的片段然后與用BamHI和XhoI進行雙酶切的真核表達載體pVAXl連接，轉化細菌，提取質粒并雙酶切鑒定真核表達載體pVAX I-GSPl (如圖I)。4、將重組質粒轉染Hela細胞，G418選擇培養基篩選。對轉染細胞進行間接免疫突光試驗以及重組質粒的Western blotting鑒定(如附圖2,3所示)。試驗例I I、體液免疫檢測30只BALB/c小鼠，隨機分成3組。共免疫3次，I次/2周。重組質粒DNA:佐劑=Iyg :0.5μ ，其余用水補足，混合均勻。免疫途徑均為肌肉注射。試驗組重組pVAXl- GSP1，IOOPg/次，佐劑為司苯甘油；空白對照組PBS ;陰性對照組pVAXl，IOC^g/次。分別于免疫前、免疫第14d、免疫第28d和免疫第42d取每組小鼠血清(尾靜脈采血，離心收集血清)，以犬惡絲蟲成蟲抗原為包被抗原，常規間接ELISA常規方法操作，檢測原核表達的重組蛋白免疫小鼠后的體液免疫水平。SPSS軟件統計學分析所得數據。2、細胞免疫水平的檢測于免疫第42d，分別每組處死5只小鼠，無菌摘取脾臟；力口入2mLPBS液,于300目篩上研磨,將研磨液吸入試管,加入2mL PBS,室溫1000g/min離心IOmin,棄去上清；PBS液清洗沉淀I次，加蒸餾水lmL，渦旋振蕩20s，加入5mL PBS,靜置5min ;取上清ImL,加入PBS lmL, 1000g/min離心IOmin,棄上清，向沉淀加入PBSlmL ;計數PBS稀釋至含IO6個/mL細胞的懸液，取其中100 μ L，加FITC標記的抗⑶4+、⑶8+單抗，避光20min，熒光洗液洗2次，加O. 5mL熒光保存液，流式細胞儀檢測⑶4+、⑶8+ T淋巴細胞的數量；SPSS軟件統計分析所得數據。3、分別在免疫前，一免、二免、三免后兩周對小鼠尾靜脈采血的間接ELISA方法檢測犬惡絲蟲抗體滴度及其變化結果(見表I及圖4)。結果表明試驗組血清IgG滴度隨著免疫次數的增加逐漸升高。第三次免疫后IgG滴度與佐劑和空白對照組相比均差異極顯著(P〈0. 01)，而佐劑與空白對照組相比差異不顯著(P>0. 05)。可見，試驗組小鼠免疫后能誘導機體產生較強體液免疫應答。表I重組核酸疫苗免疫小鼠特異性抗體效價檢測本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種犬惡絲蟲的保護性抗原基因，如SEQ ID NO. I所示。2.權利要求I所述基因的擴增引物，其特征在于FI : 5 ’ - GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3，，SI :5’ -CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3'3.一種犬惡絲蟲核酸疫苗,其特征在于將犬惡絲蟲保護性抗原基因插入到真核載體PVAXI，獲得了核酸疫苗pVAXl-GSPl。4.權利要求3所述犬惡絲蟲核酸疫苗的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張西臣，李建華，侯洪烈，宮鵬濤，程柏淇，張國才，楊舉，李赫，陳玉江，
申請(專利權)人：吉林大學，
類型：發明
國別省市：