奶山羊PITX1基因單核苷酸多態(tài)性位點及其檢測方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)奶山羊PITX1基因單核苷酸多態(tài)性位點及其檢測方法和應(yīng)用，屬于動物分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。該基因單核苷酸多態(tài)性位點包括奶山羊PITX1基因第201位為G或A的單核苷酸多態(tài)性位點，基因型為GG、GA、AA。通過以包含PITX1基因的DNA序列為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶山羊PITX1基因；然后利用限制性內(nèi)切酶MspI對PCR產(chǎn)物進行酶切；再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物即可鑒定奶山羊PITX1基因的單核苷酸多態(tài)性位點。本發(fā)明專利技術(shù)的方法具有能在奶山羊的標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種中，有利于快速建立遺傳資源優(yōu)良的奶山羊種群，而且該方法操作簡單、快速，成本低，而且檢測的精確度高的優(yōu)點。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于動物分子遺傳育種
，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測及其應(yīng)用，具體涉及奶山羊PITXl (成對同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子I)基因(以序列Accession No. NW_003104033為參考)單核苷酸多態(tài)性位點及其檢測方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
與奶牛相比，奶山羊更適用于在惡劣環(huán)境條件下飼養(yǎng)，因為它具有較強抗逆性；與牛奶相比，羊奶具有更高的營養(yǎng)價值，因為它的脂肪球小，不含過敏原，酸值低，比牛奶更易為人體吸收，在國際營養(yǎng)界被譽為“奶中之王”。然而目前，我國奶山羊產(chǎn)業(yè)相對滯后，利用 優(yōu)良奶山羊群體獲得羊奶的數(shù)量與質(zhì)量，與發(fā)達國家相比差距巨大，與目前國內(nèi)主流的奶牛業(yè)發(fā)展“不可同日而語”。為此，作為我國“十二五”規(guī)劃中奶業(yè)發(fā)展計劃的重要組成部分，奶山羊業(yè)的發(fā)展迫在眉睫，但是目前，我國該產(chǎn)業(yè)發(fā)展滯后，其根本原因在于我國奶山羊品種種源不足和種群遺傳品質(zhì)較差。因此，如何提高奶山羊種群遺傳品質(zhì)，從而增加奶山羊的產(chǎn)奶量并改善乳品質(zhì)，是目前我國奶山羊遺傳育種專家尚待解決的關(guān)鍵問題。奶山羊泌乳性能主要包括產(chǎn)奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、乳固體物含量等，屬于具有重要經(jīng)濟價值的數(shù)量性狀位點(QTL)，由微效多基因控制，且遺傳カ較低。在奶山羊育種方面，僅靠傳統(tǒng)育種手段對這些泌乳性狀進行改良，無疑是非常緩慢的，而且效果也不會很理想，因此，應(yīng)用DNA標(biāo)記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而增加奶山羊的產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)的先進的有效的方法。因為DNA標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、遺傳穩(wěn)定、不受組織、生理發(fā)育階段及環(huán)境影響等諸多優(yōu)點。此外，隨著DNA標(biāo)記的種類與數(shù)目的增多，基因圖譜密度與精度在不斷提高，為遺傳改良提供了新的策略，使DNA標(biāo)記輔助選擇(MAS)成為ー種具有廣闊前景的分子育種技木。由此可見，利用DNA標(biāo)記介導(dǎo)的MAS方法和傳統(tǒng)育種方法對奶山羊泌乳性狀進行改良、提高，必將極大地加速選擇進展，提高選擇準(zhǔn)確性。目前，利用DNA標(biāo)記進行MAS育種的主要步驟如下首先，在DNA水平上快速篩查與檢測影響奶山羊泌乳性狀的密切相關(guān)的基因；其次，建立基因多態(tài)與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)分祈，確定與泌乳性狀顯著關(guān)聯(lián)的DNA標(biāo)記或SNP位點；最后，實現(xiàn)遺傳標(biāo)記輔助選擇和實現(xiàn)早期診斷選擇。具體而言，關(guān)于DNA標(biāo)記與奶山羊泌乳性狀之間關(guān)系的研究，主要有兩種基本方法候選基因分析和連鎖標(biāo)記分析。在奶山羊研究中，候選基因分析比連鎖標(biāo)記分析更易操作，且不需要進行特意實驗設(shè)計、費用低、統(tǒng)計功效強，被廣泛采用，適用于任何可取得基因型和表型數(shù)據(jù)的群體。該方法通過統(tǒng)計方法建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，從而確定該候選基因與未知基因的關(guān)系或效應(yīng)。通常來說，候選基因是ー些與泌乳性狀有關(guān)的重要基因，可能是結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因或是在生化代謝途徑中影響該性狀表達的基因。眾所周知，生長激素(GH)能夠促進哺乳動物生長、泌乳、細胞増殖。泌乳素(PRL)也能夠顯著地影響哺乳動物的生長、泌乳以及免疫系統(tǒng)；而且，已有研究表明，GH和PRL基因突變能夠顯著影響哺乳動物的泌乳期和泌乳性能。因此，GH基因、PRL基因以及它們的正調(diào)控因子基因均可作為影響泌乳性能的關(guān)鍵候選基因。同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子(PITX)類轉(zhuǎn)錄因子成員在基因活化、垂體發(fā)育中的的關(guān)鍵性作用，啟發(fā)此類基因與泌乳性能的關(guān)聯(lián)性研究。作為PITX家族的重要成員，同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子I(PITXl)基因被分別定位在人類第5號染色體、小鼠和原雞第13號染色體、牛第7號染色體，但山羊的相應(yīng)信息尚未公布。序列比對結(jié)果表明，PITXl在人類、黒猩猩、狗、鼠、雞、斑馬魚和牛中的序列高度保守，在許多發(fā)育通路中發(fā)揮重要作用，包括影響腦垂體的器官發(fā)生，影響GH、PRL、促甲狀腺激素(TSH)的表達從而影響動物的泌乳性能。值得ー提的是，PITXl是在發(fā)育中的小鼠、雞的胚胎的后肢、口腔上皮組織、臂弓等處被發(fā)現(xiàn)的，其決定著肌肉、骨骼等的形態(tài)。此外，敲除PITXl基因的小鼠表現(xiàn)出在垂體、后肢和味覺發(fā)育上的缺陷和障礙。因此，PITXl基因是垂體-下丘腦軸相關(guān)激素基因(如PRL和GH)的重要的調(diào)節(jié)器，是已知的代表垂體發(fā)育的重要標(biāo)記基因之一。所謂單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/ G)的變化而引起的多態(tài)性，其變異形式主要有顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等。近年來，已發(fā)展出了許多用于探尋基因SNP的方法，例如DNA序列測定法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準(zhǔn)確檢測SNP的方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的有經(jīng)驗的技術(shù)人員，所以，DNA序列測定法不是ー種應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的理想的SNP檢測方法；利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP，可以適當(dāng)降低檢測費用，但是，其實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陰性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為ー種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點；而用引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測SNP位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。綜上所述，PCR-RFLP法是當(dāng)前檢測SNP最為理想的遺傳標(biāo)記方法。最新研究表明，關(guān)于PIXl基因SNP研究多見于人、小鼠等生物的體外表達分析，且常被作為器官機能缺陷和重要的疾病預(yù)測相關(guān)的候選基因，而鮮見于家畜和家禽SNP分析。截至目前，關(guān)于奶山羊PITXl基因SNP研究尚未見相關(guān)報道。中國奶山羊PITXl基因SNP領(lǐng)域的研究匱乏，基因位點的功能研究及其遺傳變異與泌乳性能(如產(chǎn)奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、乳固體物含量等)的關(guān)聯(lián)研究仍是空白。由于PITXl基因SNP位點在動物生產(chǎn)實踐中對形成胚胎、調(diào)控生長激素和促進垂體分泌激素等具有重要的作用，本專利技術(shù)提供的檢測方法為PITXl基因SNP與奶山羊泌乳性狀之間關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國奶山羊泌乳性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的奶山羊種群，從而提高種群遺傳品質(zhì)，増加奶山羊的產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)，為我國奶山羊業(yè)的發(fā)展提供理論與實踐資料。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)解決的問題是，利用PCR-RFLP方法快速檢測奶山羊PITXl基因SNP，并將其與奶山羊泌乳性狀進行關(guān)聯(lián)分析，驗證其作為奶山羊分子育種中輔助選擇的DNA標(biāo)記，從而加快良種選育速度。為了實現(xiàn)上述專利技術(shù)的目的，本專利技術(shù)采取如下的技術(shù)方案奶山羊PITXl基因單核苷酸多態(tài)性位點，其中，該基因單核苷酸多態(tài)性位點包括奶山羊PITXl基因第201位為G或A的單核苷酸多態(tài)性位點，基因型為GG、GA、AA。 ー種檢測奶山羊PITXl基因單核苷酸多態(tài)性位點的方法，包括下述步驟(I)、以包含PITXl基因的DNA序列為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶山羊PITXl基因；(2)、然后利用限制性內(nèi)切酶MspI對步驟(I本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.奶山羊PITXl基因單核苷酸多態(tài)性位點，其特征在于該基因單核苷酸多態(tài)性位點包括奶山羊PITXl基因第201位為G或A的單核苷酸多態(tài)性位點，基因型為GG、GA、AA。2.ー種檢測奶山羊PITXl基因單核苷酸多態(tài)性位點的方法，包括下述步驟 (1)、以包含PITXl基因的DNA序列為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶山羊PITXl基因; (2)、然后利用限制性內(nèi)切酶MspI對步驟(I)獲得的PCR產(chǎn)物進行酶切； (3)、再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(2)獲得的酶切產(chǎn)物即可鑒定奶山羊PITXl基因的單核苷酸多態(tài)性位點包括第201位為G或A的單核苷酸多態(tài)性位點，基因型為GG、GA、AA ； 所述的引物對P為 上游引物F :5' -CCGCCTTCCACCTAGCCCGCAC-3'； 下游引物R : 5'...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：藍賢勇，趙海諭，李轉(zhuǎn)見，潘傳英，陳宏，雷初朝，
申請(專利權(quán))人：西北農(nóng)林科技大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：