本發明專利技術公開了一種檢測狼山雞基因單核苷酸多態性的方法，以包含POU1F1基因的待測狼山雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增POU1F1基因；然后進行進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定狼山雞POU1F1基因第3109位的單核苷酸多態性。本發明專利技術把PCR產物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結合起來解決了SSCP的不穩定性，以防突變位點的漏檢，提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與狼山雞生長性狀密切相關的遺傳標記，可用于狼山雞的輔助選擇和分子育種。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及狼山雞POUlFl基因第3109酸多態性位點及其檢測方法。
技術介紹
基因多態性是指不同物種或同一物種內不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，它包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數的變化。單核苷酸多態性(SNP)指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其 中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。根據對遺傳性狀的影響，基因多態性又可分為兩種一種是同義突變多態性，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義突變多態性，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而產生蛋白質序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。因此，對編碼區SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響；尤其對于無義密碼子突變來說，更可能會導致所編碼的蛋白發生重大變化，從而影響它的功能發揮，對個體的表現型產生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。近年來，人們發展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP)、PCR-RFLP和直接測序技術等。SSCP可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Takao經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現，他認為現在知道的所有單堿基改變絕大多數可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。垂體特異性轉錄因子(Pituitaryspecific transcription factor I, POUlFl,原稱pit-1)，由Pit-I基因編碼，是家禽垂體前葉特異表達的一種具有重要功能的DNA結合蛋白，參與調節機體的細胞生長與發育。POUlFl與垂體中PRL基因、GH基因、TSHP基因以及Pit-I自身的啟動子結合，調控這些基因的轉錄，通過調節這些基因的表達而對家禽的生長、發育、繁殖和免疫等很多方面起著重要的作用。POUlFl基因被認為是神經內分泌生長軸的重要成員，對動物的生長發育發揮著重要調節作用。POUlFl基因已被當作重要候選基因在畜禽中開展了大量研究，目前已被證明與豬、牛、山羊、等眾多畜禽的生長發育、屠宰性狀及肉質性狀顯著相關。狼山雞作為我國古老的優良地方品種，是著名蛋肉兼用型雞種之一。目前，狼山雞的開發利用處于最佳發展時期。但是迄今為止，在狼山雞上關于POUlFl基因的遺傳特征以及基因多態性與狼山雞的生長性狀之間的相關性尚未有報道，基于已有的研究成果，將進一步探討POUlFl基因的功能。
技術實現思路
本專利技術解決的問題在于利用PCR產物混合測序的方法篩查狼山雞POUlFl基因的多態性位點，提供了一種狼山雞POUlFl基因多態性的篩查和檢測方法。通過關聯分析尋找與狼山雞生長性狀相關的SNP作為分子標記，以功能SNP作為狼山雞分子育種和輔助選擇的標記，加快良種選育速度和提聞種群品質。本專利技術是通過以下技術方案來實現本專利技術根據POUlFl基因的外顯子設計引物，以狼山雞的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對PCR產物混合并純化，測序后得到在狼山雞POUlFl基因(GenBank登錄號為NC_006088)的第3109位為G或A的堿基多態性位點的部分序列。 狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點，其中，所述基因單核苷酸多態性位點包括在狼山雞POUlFl基因的第3109位為G或A的堿基多態性位點。上述技術方案中所述的狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，包括以下步驟(I)、以包含POUlFl基因的待測狼山雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增狼山雞POUlFl基因；所述的引物對P為上游引物5’TTTCTTTTGGTTTTGTTCAG3’下游引物5’TTTTCAGCCTTTTGTTGG3’ ；(2)、對步驟(I)的PCR擴增產物進行切膠回收及純化、測序；(3)、對步驟(2)的純化產物進行PCR-SSCP檢測用變性劑對PCR擴增產物進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定狼山雞POUlFl基因的多態性位點。上述技術方案中所述的檢測方法，其中，所述的PCR擴增的反應程序為95°C預變性 4min ;94°C變性 50s，59°C退火 50s，72。。延伸 lmin，33 個循環，最后 72°C延伸 10min,4°C保存。上述技術方案中所述的檢測方法，其中，步驟(2)中用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行切膠回收及純化、測序；優選的所用瓊脂糖凝膠的質量濃度為I. 5%。上述技術方案中所述的檢測方法，其中，步驟(3)中聚丙烯酰胺凝膠的質量濃度為 10% O上述技術方案中所述的檢測方法，其中，步驟(3)中根據10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定狼山雞POUlFl基因的多態性位點，所述位點包括所述多態性位點包括在狼山雞POUlFl基因的第3109位為G或A的堿基多態性位點，表現為CC，CD，DD三種基因型。本專利技術利用PCR-SSCP方法對狼山雞POUlFl基因第3外顯子3109位點上的錯義突變可能產生編碼蛋白構象發生變化的單核苷酸多態性進行檢測。本專利技術對狼山雞上述SNP進行了基因分型和基因頻率分析，同時也對SSCP多態位點與狼山雞生長性狀之間進行了關聯分析。與現有技術相比，本專利技術把PCR產物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結合起來解決了 SSCP的不穩定性，以防突變位點的漏檢，提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與狼山雞生長性狀密切相關的遺傳標記，可用于狼山雞的輔助選擇和分子育種。附圖說明I、圖I是本專利技術的技術流程示意圖；2、圖2是本專利技術中PCR產物混合測序篩查到的狼山雞POUlFl基因序列3109位G-A突變測序結果圖；3、圖3為本專利技術用來檢測PCR產物片段大小的I. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖； 4、圖4為本專利技術用來檢測各樣本突變情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。具體實施例方式為使本專利技術的技術方案便于理解，以下結合具體實施例對本專利技術作進一步的說明。本專利技術首先根據POUlFl基因的保守序列設計引物，以狼山雞的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，混合PCR產物并對其純化，測序。然后，進行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態位點的PCR-SSCP檢測；最后，根據在群體中檢測到的基因型，進行群體遺傳統計分析和生長性狀的關聯分析，篩選出與狼山雞生長性狀密切相關的分子標記。下面對本專利技術做詳細說明，所述是對本專利技術的解釋而不是限定。實施例一一、狼山雞POUlFl基因部分DNA序列的擴增與測序I本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點，其特征在于所述基因單核苷酸多態性位點包括 在狼山雞POUlFl基因的第3109位為G或A的堿基多態性位點。2.權利要求I所述的狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、以包含POUIFI基因的待測狼山雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增狼山雞POUlFl基因； 所述的引物對P為 上游引物5’ TTTCTTTTGGTTTTGTTCAG3 下游引物5’ nTTCAGCCITTTGITGG3’ ； (2)、對步驟(I)的PCR擴增產物進行切膠回收及純化、測序； (3)、對步驟(2)的純化產物進行PCR-SSCP檢測用變性劑對PCR擴增產物進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定狼山雞POUlFl基因的多態性位點。3.如權利要求2所述的狼山雞POUlFI基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于所述的PCR擴增的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳宏，劉垚，房興堂，張春雷，嚴林俊，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：
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