本發明專利技術涉及一種用于分離和鑒定Ac/Ds轉座子側翼序列的引物及方法。該引物為：a.用于分離Ac/Ds5’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQIDNO：1～SEQIDNO：7所示的堿基序列；b.用于分離Ac/Ds3’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQIDNO：8～SEQIDNO：14所示的堿基序列。本發明專利技術涉及一種用于鑒定區分Ac和Ds側翼序列的特異性引物及方法，其特征在于該引物為：SEQIDNO：15～SEQIDNO：18所示的堿基序列。利用這些Ac特異性引物可以很好擴增獲得基因組中的Ac或Ds的側翼序列。這種檢測方法操作簡單，為大規模的獲得Ac突變體的Ac側翼序列和分離Ac插入突變體的基因的重要的技術手段。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及用于分離和鑒定玉米Ac/Ds轉座突變體中Ac/Ds轉座子側翼序列的特異性引物。
技術介紹
玉米是全球第一大糧食作物，是全世界主要的糧食來源。我國玉米的總產量已超過小麥，成為僅次于水稻的第二大糧食作物。而且玉米長期以來都是一種遺傳模式植物。玉米B73基因組的序列測定已經完成，這將加快玉米方面的科學研究。預計在玉米中至少存在3. 2萬個基因，這些基因的克隆和功能分析已成為下一個重要的挑戰。在眾多基因克隆的方法中，插入突變研究一種非常有效的手段。主要包括T-DNA插入突變和轉座子插入突變。由于轉基因技術的限制，在玉米中很難應用T-DNA插入法進行插入突變分析。但是在玉米存在內源的轉座子是很好的進行插入突變研究的工具。目前在玉米中最主要的用于 創建插入突變體的轉座子是Mutator (Mu)和Activator/Dissociator (Ac/Ds)兩個系統。Mu因子具有轉座頻率高，正向突變率高和全基因組范圍插入的特點，目前在國內外已有幾個較大規模的Mu插入突變體庫，并以用于玉米分離和克隆玉米基因。Ac/Ds雖然其轉座頻率較Mu轉座子低，但其在玉米基因組拷貝數低，傾向于向連鎖位點轉座和傾向于插入低甲基化的基因富集區，近年來被作為與Mu互補的系統廣泛的用于構建插入突變體庫和進行基因的定向插入突變分析。在分離鑒定轉座系和利用轉座子標簽法克隆基因的過程中，分離轉座子的側翼序列是一個重要的環節。傳統的分離Ac/Ds側翼序列的方法是以Ac或Ds的部分序列作為探針，通過Southern雜交來鑒定在每一個轉座系材料中所對應的特異條帶，然后回收特異條帶區域的DNA并進行分子內的自連接，再通過反向PCR的方法來擴增特異條帶，最后將側翼條帶測序并驗證。這種方法對DNA的需要量大,而且做Southern和反向PCR是耗時費力的方法，難以提高實驗效率。因此建立操作簡單、快速高效的Ac/Ds側翼序列分離和鑒定方法對于Ac/Ds插入突變體的鑒定和利用轉座子標簽法進行基因克隆都具有重要的意義。Siebert等利用一種部分雙鏈的接頭連接到經過酶切的平末端的DNA片段上,然后利用接頭引物和基因特異性的引物通過嵌套PCR擴增基因上游或下游的序列。由于在接頭的短鏈的3’末端用氨基封閉，減少了由于接頭引物單獨擴增帶來的非目的條帶，從而提高了 PCR產物的特異性。Ji和Braam利用產生3’突出端的內切酶酶切基因組DNA，然后利用在引物的3’端帶有與突出末端互補堿基的接頭引物和基因特異性引物擴增，這種方法中省去了連接的步驟，進一步提高了實驗的效率。
技術實現思路
本專利技術的目的之一在于提供一種用于分離Ac/Ds轉座突變體中Ac/Ds轉座子側翼序列的特異性引物。本專利技術的目的之二在于提供利用該特異性引物分離Ac/Ds轉座突變體中Ac/Ds轉座子側翼序列的方法。本專利技術的目的之三在于提供一種用于鑒定上述Ac/Ds轉座子側翼序列是Ac還是Ds的側翼序列的特異性引物。本專利技術的目之四在于提供利用該特異性引物區分鑒定Ac和Ds轉座子側翼序列的方法。為達到上述目的，本專利技術采用如下技術方案 一種用于分離Ac/Ds轉座子側翼序列的特異性引物，其特征在于該引物為 a.用于分離Ac/Ds5’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQ ID NO :1 SEQ ID NO:7所不的喊基序列； b.用于分離Ac/Ds3’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQ ID NO :8 SEQ ID NO:14所不的喊基序列。一種分離Ac/Ds轉座子側翼序列的方法，采用上述的特異性引物，其特征在于該方法的具體步驟為 a.取10 15株植株的DNA等量混合后，進行限制性內切酶酶切，得到酶切產物； b.對于步驟a所得酶切產物，如是平末端產物，則連接平末端接頭后，選擇一種相應的Ac末端特異性引物和接頭引物進行第一輪PCR擴增，得到擴增產物； c.將步驟b所得的PCR擴增產物經稀釋后作為模板，再用第二輪Ac末端特異性引物和接頭引物進行第二輪PCR擴增，得到Ac/Ds轉座子側翼序列。d.對于步驟a所得酶切產物，如是3’突出末端產物，則選擇一種相應的Ac末端特異性引物和RSE接頭引物進行第一輪PCR擴增，得到擴增產物； e.將步驟d所得的PCR擴增產物經稀釋后作為模板，再第二輪Ac末端特異性引物和RSE接頭引物進行第二輪PCR擴增，得到Ac/Ds轉座子側翼序列。上述步驟a得到的酶切產物為平末端，其連接接頭的接頭序列為由接頭I和接頭2退火獲得；所述的接頭I的序列為SEQ ID NO 19所不的喊基序列；所述的接頭2的序列為SEQ ID NO :20所示的堿基序列；所述的第一輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :21所示的堿基序列。所述的第二輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :22所示的堿基序列。上述的步驟b中，對平末端的酶切產物的PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，13 個循環(94° C 30 秒，72° C 20 秒-1° C/秒，72° C I 分鐘)20 個循環(94° C 30 秒，57° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72° C 8分鐘。上述的步驟c中，對平末端的酶切產物的第一輪PCR產物的PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，13個循環(94° C 30秒，72° C 20秒-1° C/秒，72° C I分鐘)30個循環(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72。C 8分鐘。如上述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :24或SEQ ID NO :25所示的堿基序列；其第二輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :26所示的堿基序列。上述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增條件為94。C預變性3分鐘，94° C 30秒，45° C 20秒，72° C 5秒鐘，11個循環(94° C 30 秒，72° 0 20秒-1° C/秒，72° C I 分鐘)20 個循環(94° C 30 秒，62° C 20 秒，72° CI分鐘)，過度延伸72° C 8分鐘。上述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增條件為94。C預變性3分鐘，13個循環(94° C 30秒，72。C 20秒-I。C/秒，72。C I分鐘)25個循環(94° C 30秒，60° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72。C 8分鐘。一種用于鑒定區分Ac和Ds側翼序列的特異性引物，其特征在于該引物為SEQID NO :15 SEQ ID NO 18所示的堿基序列。一種鑒定區分Ac和Ds側翼序列的方法，采用上述的特異性引物，其特征在于該方法的具體步驟為 a.對于來自于aptl-ml::Ac和bz-m2(DI)系統的轉座事件，我們可以用引物SEQ IDN0:17和SEQ ID NO :15和配合相應的側翼序列的引物擴增。根據產物大小可判斷側翼序列是否是Ac的側翼序列。即如以SEQ ID NO 17和對應的5’側翼序列特異性引物進行擴增獲得2670bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ I本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.ー種用于分離Ac/Ds轉座子側翼序列的特異性引物，其特征在于該引物為 a.用于分離Ac/Ds5’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQ ID NO :1 SEQ IDNO 7所不的喊基序列； b.用于分離Ac/Ds3’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQ ID NO :8 SEQ IDNO 14所不的喊基序列。2.一種分離Ac/Ds轉座子側翼序列的方法，采用根據權利要求I所述的特異性引物，其特征在于該方法的具體步驟為 a.取10 15株植株的DNA等量混合后，進行限制性內切酶酶切，得到酶切產物； b.對于步驟a所得酶切產物，如是平末端產物，則連接平末端接頭后，選擇ー種相應的特異性引物和接頭引物進行第一輪PCR擴增，得到擴增產物； c.將步驟b所得的PCR擴增產物經稀釋后作為模板，再用第二輪特異性引物和接頭引物進行第二輪PCR擴增，得到Ac/Ds轉座子側翼序列； d.對于步驟a所得酶切產物，如是3’突出末端產物，則選擇一種相應的特異性引物和RSE接頭引物進行第一輪PCR擴增，得到擴增產物； e.將步驟d所得的PCR擴增產物經稀釋后作為模板，再第二輪特異性引物和RSE接頭引物進行第二輪PCR擴增，得到Ac/Ds轉座子側翼序列。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟a得到的酶切產物為平末端，其連接接頭的接頭序列為由接頭I和接頭2退火獲得；所述的接頭I的序列為SEQ ID NO: 19所示的喊基序列；所述的接頭2的序列為SEQ ID NO 20所不的喊基序列；所述的第一輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO 21所不的喊基序列； 所述的第二輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :22所示的堿基序列。4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟b中，對平末端的酶切產物的PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，13個循環(94° C 30秒，72° C 20秒-1° C/秒，72° C I分鐘)20個循環(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72。C 8分鐘。5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟c中，對第一輪擴增產物的PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，13個循環(94° C 30秒，72° 0 20秒-1° C/秒，72° CI分鐘)30個循環(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72° C 8分鐘。6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO 23, SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示的堿基序列；其第二輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :26所示的堿基序列。7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，94° C 30秒，45° C 20秒，72° C 5秒鐘，11個循環(94° C 30秒，72° C...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王飛，李鵬飛，徐大彬，郭圣明，趙志偉，樊軍，宋任濤，許政暟，
申請(專利權)人：上海大學，
類型：發明
國別省市：
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