本發明專利技術屬分子免疫領域，涉及一種乙肝病毒核心抗原的核酸適配體序列及用途。本發明專利技術采用基因重組質粒表達核心抗原，并篩選與其特異結合的核酸適配體，制得具有特異結合HBV核心抗原的特征序列CATTT。本發明專利技術所述的特征序列是核酸適配體與HBc特異性結合的基礎，可用于藥物設計、制備藥物或其他制品，所述的含有該特征序列的核酸適配體可作為抗HBV的探針或靶點，用于設計、制備抗乙肝病毒的藥物或制劑。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬分子免疫領域，涉及ー種こ肝病毒核心抗原的核酸適配體的序列及其用途。
技術介紹
こ型肝炎(こ肝)是嚴重危害我國人民健康的主要傳染病，據世界衛生組織(WHO)統計，我國こ型肝炎病毒(こ肝病毒，HBV)攜帯者達I. 3億，肝病患者高達3000萬，毎年因各類肝病死亡人數達30萬。肝病已經成為當今威脅中國人ロ健康的主要疾病之一，數量巨大的慢性肝病患者的存在，以及每年新發現肝炎病例的出現，對社會醫療資源造成極大的消耗。研究顯示，こ肝病毒是こ型肝炎的主要致病原，病原明確。目前こ肝的治療效果并不是很理想，臨床實踐顯示こ肝病毒已對大部分治療藥物產生了耐藥性，因此，亟待開發新的 對抗こ肝病毒的治療手段?，F有技術公開了こ肝病毒的DNA序列，其主要含有四個編碼區，分別為S、P、C、X開放讀框；其中，C開放讀框編碼核心抗原(HBcAg)，該核心抗原是診斷こ肝病毒感染的重要標志之一。有研究指出，對こ肝病毒自身生活周期密切相關的蛋白或酶進行干預是殺滅和抑制病毒的有效策略之一，也是未來診斷和治療こ肝的理想方向。目前，已知核酸適配體(aptamer)是經體外篩選技術篩選出的能特異結合金屬離子、多肽、蛋白質乃至整個細胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段，其特異性如同抗體一祥，對可結合的配體有嚴格的識別能力和高度的親和力。核酸適配體的體外篩選技術被稱為指數富集的配體糸統進化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技術，SELEX技術模擬自然進化過程，對隨機寡核苷酸文庫施加選擇壓力(結合靶目標)，淘選與靶目標高度特異結合片段(如圖I所示);相比抗體等多肽類的適配體(peptideaptamer),核酸適配體的優勢相當明顯,例如制備簡單快捷、化學性質穩定、至今未見報道存在免疫原性或毒性、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強、易于進行改造修飾等。核酸適配體的諸多優勢令其在基礎研究、臨床檢測、新藥開發等方面有著廣泛的用途。在臨床檢測方面，目前能用抗原抗體反應進行檢測的技術幾乎都可以用核酸適配體替代，如Archemix公司開發的一種適配體分子傳感器-RiboReporter 即可以將檢測到的蛋白信號直接轉化成光信號記錄并分析，從而實現了對生物混合液(如血清、細胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速檢測。在新藥開發方面，最典型的例子便是第一個通過美國FDA批準上市的核酸適配體藥物Macugen。它是抗血管內皮細胞生長因子(VEGF)的核酸適配體，被用于治療濕性老年性黃斑變性(wet AMD)。另ー個核酸適配體藥物的例子是由Aptamera公司研制的AGRO100。臨床前試驗表明，AGR0100對多種癌細胞均有抑制作用。目前國內外大部分從事核酸適配體研究的科學家和生物技術公司主要針對心血管疾病，而較少關注中國人的常見疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等，因此本專利技術擬考慮核酸適配體如何應用于上述嚴重威脅我國人民健康的重大疾病。就こ肝病毒來說，已有研究報道了針對こ肝病毒核心抗原的肽適配體，但迄今尚無針對こ肝病毒的核酸適配體的報道或公開。因此，開發針對こ肝病毒的核酸適配體，將為こ肝病毒的診斷和抗こ肝病毒治療提供有力支持，具有重要的臨床價值。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，具體涉及ー種HBV核心抗原的核酸適配體中具有特異結合HBV核心抗原的特征序列。本專利技術中，所述的HBV核心抗原的核酸適配體(序列I)中含有特異結合HBV核心抗原的特征序列，所述的特征序列為CATTT。 本專利技術中，所述的こ肝病毒核心抗原選自こ肝病毒株A、B、C、D、E、F、G、F、G或H基因型。本專利技術的進ー步目的是提供所述核酸適配體序列的用途，根據對該序列分析，設計抗HBV感染的藥物并進ー步制備抗HBV感染的藥物或制品。本專利技術采用基因重組質粒表達核心抗原，并篩選與其特異結合的核酸適配體，制得具有特異結合HBV核心抗原的特征序列CATTT (本專利技術中命名為華山適配體I號，簡稱HSSTOl)。通過以下技術方案實現 采用已知的分子克隆技術，以含有雙拷貝HBV基因組序列的重組質粒pBS_HBV3.6II(序列2)為基礎，根據HBc基因序列設計引物HBc_L :5’ -GCCCATATGGACATTGACCCGTA-3’ ；HBc_R:5’ -GCCCTCGAGTCAAACAACAGTAGTTT-3’ ； 通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增出HBc基因，用限制性內切酶NdeI和NotI酶切，同時用相同的限制性內切酶切pET28a質粒(購自北京畢特博生物公司)，然后用T4連接酶連接入pET28a的Ndel/Notl酶切位點中，制得含HBc基因的重組質粒pET28a_HBc (質粒結構如圖2所示)； 將含有pET28a-HBc的大腸桿菌BL21 (DE3)(購自上海杰慶生物公司)單菌落接種到含卡納抗生素的LB培養基中，培養過夜，將培養物轉移至200mL新鮮培養基中培養，IPTG誘導表達后離心收集菌體； 用 5mL 裂解液(50mM Tris-HCl(pH8. 5 9. 0)，2mM EDTA, IOOmM NaCl, O. 5% TritonX-100, lmg/ml溶菌酶)重懸細菌，冰浴中IOOw超聲破碎；取Iml上清與500ulNi_NTAAgarose珠子混合,用2ml PBS+Mg( ImM MgC12)洗兩遍,再用2ml PBS+Mg重懸，吸出蛋白-珠子混合物，加Roche cOmplete Mini EDTA-free蛋白保護劑保存。隨后利用核酸適配體的體外篩選技術即SELEX技木，以HBc蛋白-珠子混合物為正篩靶標，以含pET28a空白質粒的大腸桿菌表達產物-珠子混合物為反篩靶標，從體外合成的隨機寡聚 DNA 文庫(5’ -acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’ )中篩選出與HBc特異結合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物 Aptamer_L (5’ -FAM-acgctcggatgccactacag-3’)和 Aptamer_R (5’ -biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’ )進行擴增并進行TA克隆入pMD19_T載體(購自上海博光生物公司)，轉化DH5a細菌(購自北京天根生物公司)；挑去白色菌落以引物RV-M(5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)和 M13 (-47) (5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)進行PCR確定陽性克隆后，抽提質粒并用M13 (-47) (5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ )為測序引物進行測序反應，采用測序儀測序。本專利技術中，所述的核酸適配體序列選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來源的同樣的序列； 所述的核酸適配體序列含有與所述特征序列的核苷酸的全部相同的序列，即所有核酸適配體均含有所述的特征序列。本專利技術所述的特征序列是核酸適配體與HBc特異性結合的基礎，可用于藥物設計、制備藥物或其他制品，所述本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，其特征在于，具有序列I的結構，其含有特異結合HBV核心抗原的特征序列。2.根據權利要求I所述的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，其特征在于，所述的特征序列為CATTT。3.根據權利要求I所述的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，其特征在于，所述的序列選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來源的同樣的序列。4.根據權利要求3所述的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，其特征在于，所述核酸適配體的序列含有與所述的特征序列的核苷酸的全部相同的序列。5...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉杰，張駿，張作偉，
申請(專利權)人：復旦大學附屬華山醫院，
類型：發明
國別省市：
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