本發明專利技術公開了一種快速檢測黃牛WNT10B基因單核苷酸多態性的方法，以包含WNT10B基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P3為引物，PCR擴增黃牛WNT10B基因，用限制性內切酶NaeI、ApaI分別消化用引物對P1、P3擴增后的PCR產物，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛WNT10B基因第220、3980位的單核苷酸多態性。本發明專利技術的方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長發育性狀密切相關的分子遺傳標記，以用于黃牛的輔助選擇和分子育種，加快黃牛良種繁育速度。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測黃牛WNTlOB基因內含子I及外顯子2、4、5的單核苷酸多態性的檢測方法。
技術介紹
單核苷酸多態性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性。因此，通常所說的SNPs包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數的變化。一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起；具有轉換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。 在任何已知或未知的基因內或附近都可能找到數量不等的SNPs，根據它們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區SNPs(cSNPs)、基因周邊SNPs(pSNPs)和基因間SNPs(iSNPs)等三類。總的說來，cSNP比較少，因為在外顯子內的變異率僅占周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關注。根據對遺傳性狀的影響，cSNPs又可分為兩種一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義cSNPs，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而產生蛋白質序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。因此，對編碼區SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響；尤其對于無義密碼子突變來說，更可能會導致所編碼的蛋白發生重大變化，從而影響它的功能發揮，對個體的表現型產生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要采用幾種不同的路線來發現SNPs :即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術人員和經驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術檢測SNP位點，需要平板讀數儀、基因芯片、微球陣列技術和質譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。RFLP-PCR方法是一種檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點后引入限制性內切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。脂肪組織不僅是重要的能量貯庫和賦形組織，還是保持內環境穩定的重要內分泌器官。動物體內存在棕色和白色兩種脂肪。白色脂肪堆積在皮下，負責儲存多余熱量；棕色脂肪負責分解引發肥胖的白色脂肪，將后者消耗，加快新陳代謝。WNTlOB(wingless-type MMTV integration site family, member IOB, WNTIOB)是fct蛋白家族19個成員之一，該蛋白家族主要負責調節胚胎發生的復雜過程，其中也包括脂肪組織的形成。WNTlOB能夠抑制脂肪沉積包括白色脂肪組織發育以及棕色脂肪生成。
技術實現思路
本專利技術解決的問題在于利用PCR-RFLP方法檢測黃牛WNTlOB基因的多態性，并將其與生長性狀進行關聯分析，驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標記，從而加快良種選育速度。本專利技術是通過以下技術方案來實現黃牛WNTlOB基因單核苷酸多態性位點，其中，該基因單核苷酸多態性包括黃牛WNTlOB基因第220位點為A或G的單核苷酸多態性位點；和第3980位點為G或T的單核苷酸多態性位點。黃牛WNTlOB基因單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，包括以下步驟(I)、以包含WNTlOB基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對Pl為引物，PCR擴增黃牛WNTlOB基因獲得第一擴增產物，并用限制性內切酶NaeI酶切第一擴增產物；(2)、以引物對P3為引物，PCR擴增黃牛WNTlOB基因獲得第三擴增產物，并用限制性內切酶ApaI酶切第四擴增產物；(3)、分別對步驟(I)和(2)酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛WNTlOB基因第220和3980位的單核苷酸多態性；所述的引物對Pl為上游引物Fl ggggaaactg aggcaaagag a ；下游引物Rl agcgggcaag cacagaact ；所述的引物對P3為上游引物 F3 :tcagacctac ccctatccac ac ；下游引物 R3 :aaacgccagg aagacccag。 上述技術方案所述的黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，步驟(I)中的PCR擴增反應程序為95°C預變性5min ;94°C變性458，66.01退火458，721延伸45s, 30 35個循環；72°C延伸IOmin ；步驟⑵中PCR擴增反應程序為95°C預變性5min ;94°C變性45s，65. 5°C退火45s, 72°C延伸 45s, 30 35 個循環；72°C延伸 IOmin0上述技術方案所述的黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，所述的瓊脂糖凝膠電泳所采用的瓊脂糖凝膠的質量濃度為2. 5%。上述技術方案所述的黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性為第220位點為A或G的單核苷酸多態性，表現為AA、AG、GC三種基因型；和第3980位點為G或T的單核苷酸多態性，表現為GG、GT、TT三種基因型。具體的第220位的多態性為AA基因型表現為355bp條帶，AG基因型表現為355、235和120bp條帶，GG基因型表現為235和120bp條帶；第3980位的多態性為GG基因型表現為244和208bp條帶，GT基因型表現為452、244和208bp條帶，TT基因型表現為452bp條帶。與現有技術相比，本專利技術具有以下有益的技術效果 本專利技術公開了與黃牛生長性狀相關的功能基因WNTlOB的第202、1617、3980、4711位的單核苷酸多態性，并且針對上述位點的SNP多態性，本專利技術還公開了其檢測方法，通過設計本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.黃牛WNTlOB基因單核苷酸多態性位點，其特征在于，該基因單核苷酸多態性包括 黃牛WNTlOB基因第220位點為A或G的單核苷酸多態性位點；和 第3980位點為G或T的單核苷酸多態性位點。2.黃牛WNTlOB基因單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、以包含WNTlOB基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對Pl為引物，PCR擴增黃牛WNTlOB基因獲得第一擴增產物，并用限制性內切酶NaeI酶切第一擴增產物； (2)、以引物對P3為引物，PCR擴增黃牛WNTlOB基因獲得第三擴增產物，并用限制性內切酶ApaI酶切第三擴增產物； (3)、分別對步驟⑴和⑵酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛WNTlOB基因第220和3980位的單核苷酸多態性； 所述的引物對Pl為上游引物 Fl ggggaaactg aggcaaagag a ； 下游引物Rl agcgggcaag cacagaact ； 所述的引物對P3為上游弓I物 F3 tcagacctac ccctatcca...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳宏，趙靜，張春雷，房興堂，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：
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