一種去除免疫印跡非特異性雜交的試劑，本發明專利技術公開了一種去除免疫印跡背景的方法，屬于生物科研領域的創新型實驗技術。本發明專利技術主要利用競爭性拮抗的原理，來消除或減弱免疫印跡實驗過程中由于高豐度蛋白質的存在造成的免疫印跡背景深或者非特異性雜交，致使實驗結果有偏差或者不能真實反應目的基因在蛋白質水平的表達差異。本發明專利技術利用重組蛋白質構建RuBisCo-out試劑盒，能夠顯著消除或減弱實驗背景，從而更好地反映目的基因在植物不同發育階段、不同組織結構中的蛋白質表達譜。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物科研領域的創新型實驗技術，屬于一種去除免疫印跡背景的方法。
技術介紹
在C3植物光合作用卡爾文循環中，1，5- ニ磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, RuBisCO)催化碳固定，從而使自然界中的無機碳進入生物鏈。該酶是雙功能酶，在CO2濃度高的環境中，使核酮糖ニ磷酸羧化酶(ribulose diphosphatecarboxylase, RUBP)進行羧化反應，起羧化酶的作用，形成磷 酸甘油酸；在O2濃度高的環境中，使RUBP進行氧化反應，起加氧酶的作用，形成磷酸こ醇酸和磷酸甘油酸。RuBisCo作為植物葉中的主要含氮有機物之一，與植物對氮的吸收、利用及循環有夫。RuBisCo也是植物葉片中ー種主要的儲存蛋白，可能是地球上最常見、含量最豐富的酶，大約占有葉片蛋白質總量的30% 50%。在提取植物葉片全蛋白質進行SDS-PAGE檢測中發現，RuBisCo的大亞基在葉片中具有非常高的豐度。近年來，對RuBisCo參與植物抗逆、抗病的研究也日益增多，彭新湘等的研究亦表明隨著水稻葉片的衰老，RuBisCo的降解速率加快。后基因組時代的到來，為更多的蛋白質功能性研究提出了挑戰，抗體能夠為免疫共沉淀、ChIP-on-chip、Pull-down以及在抗病、抗逆反應中蛋白質的表達研究提供重要資源。隨著基因組序列信息的闡釋和轉錄譜數據的積累，基于抗體的蛋白質組學將成為研究蛋白質表達譜、蛋白質相互作用等的重要的技術手段。正是由于RuBisCo在植物體內尤其是葉片中的高豐度表達，在進行針對目的基因進行蛋白質表達研究尤其是針對抗病抗逆的研究的同時，可能產生抗體與植物內源的RuBisCo大亞基的非特異性雜交，導致實驗結果的不確定性，主要表現為雜交背景深井出現明顯的RuBisCo大亞基條帶污染。由于RuBisCo進化的保守性，本專利技術在植物界中適用范圍廣泛。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種去除免疫印跡背景試劑盒，利用水稻葉片高豐度 & 臼質(Ribulose-1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunitN-methyltransferase, chloroplastic,EC = 2. I. I. 127)的同源蛋白質來消除或減弱免疫印跡中實驗背景的方法。對該蛋白質的同源蛋白質通過發酵、人工合成的方式獲得，直接加入到免疫印跡封閉液或者雜交液中，或者直接與抗體進行混合后使用及存儲，能夠消除或減弱生物體內源高豐度蛋白質造成的免疫印跡中的實驗背景。RuBisCo-out試劑盒,利用競爭性拮抗的原理,采用外源高豐度蛋白質或其同源蛋白質來消除或減弱內源高豐度蛋白質所造成的免疫印跡實驗背景。本專利技術的優點及其有益效果本專利技術利用重組蛋白質構建RuBisCo-out試劑盒，能夠顯著消除或減弱實驗背景，從而更好地反映目的基因在植物不同發育階段、不同組織結構中的蛋白質表達譜。該蛋白質可以是具有下述氣基酸殘基序列之一的蛋白質I)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)根據序列表中SEQ ID NO : I的氨基酸序列預測出的相應抗原片段序列SEQ IDNO 2 ；上述適合水稻免疫印跡研究的RuBisCo家族的編碼基因，也屬于本專利技術的保護范圍，其核苷酸序SEQ ID NO 3的核苷酸序列；3)與序列表中SEQ ID NO :2序列中任意連續14個氨基酸的相似性大于80%的多肽片段；本專利技術獲得的RuBisCo-out試劑盒,經過試驗驗證明本專利技術去除免疫印跡非特異性雜交效果，使用便利，操作方便，且具有很好的應用前景。附圖說明I、圖I是本專利技術所述的利用特異性引物擴增獲得的目的基因片段的結果。2、圖2是本專利技術所述的RuBisCo蛋白質體外表達的結果。3、圖3是本專利技術所述的使用RuBisCo-out前后的分蘗期、孕穗期和開花期水稻葉片的蛋白質表達譜的結果。具體實施例方式下述實施例中所用方法均為分子生物學實驗室所用的常規方法。生物材料和水稻材料水稻cDNA文庫、pET_30a表達載體、大腸桿菌ER2566和DH5 α菌株等由本實驗室保存。限制性內切酶BamH I、Xho I、T4 DNA Ligase, Ex Taq DNA聚合酶購自TAKARA。在水稻材料93-11 (Oryza sativa L. ssp. Indica)各時期組織樣品,所有水稻材料經液氮速凍后，保存于_70°C備用。實施例I、RuBisCo基因的克隆根據TIGR 數據庫公布的 Ribulose-1, 5 bisphosphate carboxylase/oxygenaselarge subuni tN-methy I transferase, chloroplastic 基因(SEQ ID NO :1)的片段序列設計了擴增引物，以水稻cDNA文庫為模板進行擴增(圖I)、回收，酶切連接至pET-30a表達載體，測序驗證其正確性。實施例2、RuBisCo基因的蛋白質體外表達、純化將測序正確的重組子轉化大腸桿菌，ER2566，按I : 100的比例將過夜菌轉接至100mlLB+Kan50+l%葡萄糖液體培養基中，37°C振蕩培養至0D600為O. 6 O. 8，加入O. lmol/L的IPTG，37°C震蕩培養3小時，收菌后超聲破碎，SDS-PAGE分離后檢測(圖2)，用Ni柱進行蛋白質的純化。實施例3、水稻不同發育時期的免疫印跡雜交背景去除效果選取水稻93-11三個發育階段和不同部位的組織，液氮充分研磨新鮮水稻材料至粉末狀，分裝到預冷離心管中，每300 μ L粉末加入800 μ L蛋白裂解液(62. 5mmol/LTris .Cl，pH7· 4，10% 甘油，2% SDS，20mmol/LNaF，2mmol/L EDTA, Immo I/L PMSF,5% β-巰基こ醇)，迅速混勻并置于冰上。Vortex 4-5次，在冰水混合物中孵育10分鐘，4°C，12000r/min離心15分鐘,取上清轉移到新的1.5mL離心管中，用Bradford法測定樣品水稻總蛋白含量，-70°C保存。每個樣品上樣5 μ g水稻總蛋白，SDS-PAGE分離后電轉到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，用抗體室溫孵育3小吋，同時做RuBisCo-out的使用對照。TTBS(2mmol/ L Tris *ClpH7. 6,13. 6mmol/L NaCl，O. 1% Tween-20)洗膜 3 次，每次 5min。加入羊抗兔ニ抗(中杉金橋)室溫孵育I小吋，TTBS洗膜3次，每次5分鐘。加入ECL Plus檢測液檢測(普利萊公司)，暗室中同時對X光片進行曝光，以檢測RuBisCo-out的效果。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.RuBi sCo-out試劑盒的開發，在于利用水稻葉片高豐度蛋白質(Ribulose-Ι,5disphosphate carboxylase/oxygenase large subunit N-methyltransferase,chloroplastic, RuBisCo, EC = 2. I. I. 127)來消除或減弱免疫印跡中實驗背景的方法。2.按照權利要求I所述的蛋白質或者是與其同源性大于或等于30%的同源蛋白質及肽段，通過發酵...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉國振，陳浩，尹長城，劉釗，蘭金蘋，朱健輝，謝俊華，王增，張軍，吳琳，劉斯奇，
申請(專利權)人：北京華大蛋白質研發中心有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。