本發明專利技術涉及細胞生物學技術領域。腫瘤起始細胞不僅與腫瘤的起始和進展相關，在腫瘤的侵襲和轉移中，腫瘤起始細胞同樣發揮著至關重要的作用。本發明專利技術的目的在于提供一種肝癌起始細胞，及其分離方法與應用。本發明專利技術是用特異性的OV6單克隆抗體和磁珠分選、富集肝癌起始細胞，所分離得到的OV6+肝癌起始細胞具有多種特性，用途廣泛。并將所分離得到的肝癌起始細胞用于肝癌預后分析和藥物篩選。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細胞生物學
，具體涉及ー種從肝癌細胞系和原代肝癌標本中獲得肝癌起始 細胞的方法，及其該肝癌起始細胞的應用。
技術介紹
在干細胞和腫瘤生物學的眾多進展中，腫瘤起始細胞(tumor-initiating cells)理論逐漸引起越來越多的重視。越來越多的研究證據表明，在許多實體腫瘤的發生和進展中存在具有自我更新能力的腫瘤起始細胞(參見文獻Jordan CT, Guzman ML, NobleM. Cancer stem cells. N Engl J Med. Sep 212006 ;355 (12) : 1253-1261.)。這些細胞具有自我更新能力，與腫瘤的維持和腫瘤對常規抗腫瘤療法耐受有著密切的聯系。近年來的研究還發現，腫瘤起始細胞不僅與腫瘤的起始和進展相關，在腫瘤的侵襲和轉移中，腫瘤起始細胞同樣發揮著至關重要的作用(參見文獻Diehn M, Majeti R. Metastatic cancerstem ceils :an opportunity ior improving cancer treatment : Cell btem しell. Jun4 2010 ；6(6) :502-503.)。大多數肝細胞癌都是由慢性病毒性肝炎或其他肝臟疾病引起的肝硬化或硬化前疾病發展而來，長期以來，成熟肝細胞中基因異常突變的累計被認為是腫瘤發生中的關鍵事件。但隨著肝干細胞生物學的進展，人們認為在肝細胞癌中也存在著腫瘤起始細胞，并且他們與肝癌的發生密切相關(參見文獻Yin S，Li J, Hu C，et al.⑶133 positivehepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity.Int J Cancer. Apr 12007 ；120(7) :1444-1450. ；Chiba T，Zheng YW，Kita K，etal. Enhanced self-renewal capability in hepatic stem/progenitor cells drivescancer initiation. Gastroenterology. Sep 2007 ； 133 (3) :937-950. ；Ma S，Tang KH,Chan YP, et al. miR-130b Promotes CD133(+)liver tumor-initiating cell growthand self-renewal via tumor protein 53—induced nuclear protein I.Cell StemCell.Dec 3 2010 ；7 (6) :694-707. ；Yamashita T，Ji J，Budhu A，et al. EpCAM-positivehepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitorcell features. Gastroenterology. Mar 2009 ；136 (3) :1012-1024)0由于肝癌起始細胞在肝癌的發生、發展中發揮著重要的作用，因此，對肝癌起始細胞標志物和特性的研究具有重要的意義。肝癌起始細胞具有更高的自我更新能力、成瘤性、對化療藥物的耐受性，被認為是肝癌復發和轉移的重要來源。因此，通過研究肝癌起始細胞的標志物、分離方法和特性，并將所得到的肝癌起始細胞用于肝癌預后分析和抗腫瘤藥物的篩選和制備，有助于進一歩理解肝癌發、發展的過程，進而開發出靶向肝癌起始細胞的有效治療方法。中國專利CN200510030081. O公開了ー種肝癌干細胞及其分離方法。0V6抗體是肝臟干細胞研究領域中廣泛用于檢測大鼠或人肝前體細胞的ー種in {φ ( # JAL AV Kofman, G Morgan, et ai. Dose_and time-dependent oval cel 丄reaction in acetaminophen-induced murine liver injury. Hepatology. 2005Jun ；41 (6) :1252-61. Carloni GiPonzetto A et al. Liver stem cells and possible clinicalapplications. Curr Stem Cell Res Ther. 2010Dec ；5 (4) :314-25.)，由 R&D 公司生產(MAB0202)，是ー種肝干/前體細胞標志物，但至今未有文獻報道將0V6抗體用于檢測、分選人肝細胞癌肝癌起始細胞 并研究其特性和用途。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供ー種肝癌起始細胞，本專利技術的另ー目的是提供該肝癌起始細胞的分離方法，本專利技術的另ー目的是提供該肝癌起始細胞的應用。本專利技術的ー個方面，提供了一種從肝癌細胞系和人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，它包括步驟(a)將0V6單克隆抗體與含有肝癌起始細胞的肝癌細胞系混合，形成“0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞”復合物；(b)離心去除未結合的0V6單克隆抗體，形成“ 0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞”復合物沉淀，并與磁珠標記的抗小鼠IgGl第二抗體孵育，形成“0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞-肝癌起始細胞”復合物；(C)通過磁場分離步驟(b)形成的復合物，從而獲得肝癌起始細胞。本專利技術所稱的肝癌細胞系是人肝癌細胞系，包括但不限于SMMC7721、Huh7、!fepG2、HCC-LM3。本專利技術所稱的0V6單克隆抗體，購自R&D公司。本專利技術所稱的磁珠分選系統是本領域技術人員所熟知的(參見工具書《干細胞實驗指南》，科學出版社，2006年I月)。在另ー優選例中，還提供了一種從人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，它包括步驟(a)將0V6單克隆抗體與從原代肝癌標本中分離的肝癌細胞混合，形成“0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞”復合物；(b)離心去除未結合的0V6單克隆抗體，形成“ 0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞”復合物沉淀，并與磁珠標記的抗小鼠IgGl第二抗體孵育，形成“0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞-肝癌起始細胞”復合物；(c)通過磁場分離步驟(b)形成的復合物，從而獲得肝癌起始細胞。在本專利技術的另一方面，提供了ー種從上述的分離方法獲得的肝癌起始細胞，在體外具有更強的自我更新能力，在體內具有更強的成瘤能力，具有更強的遷移和侵襲、轉移能力。在本專利技術的另一方面，提供了本專利技術的肝癌起始細胞在制備肝癌預后診斷試劑或試劑盒中的應用。 還提供了本專利技術的肝癌起始細胞在篩選抗肝癌藥物中的應用。所述的抗肝癌藥物具體為肝癌起始細胞抑制劑，篩選方法包括以下步驟(a)將候選的肝癌起始細胞抑制劑加入肝癌起始細胞培養體系中，并檢測肝癌起始細胞功能特性；(b)將步驟(a)中測試組中肝癌起始細胞功能特性與對照組比較，如果測試組功能特性指標在統計學上低于對照組，則表明該候選物為抑制肝癌起始細胞的化合物。本專利技術分離得到的0V6+肝癌起始細胞既有干細胞特性和自我更新能力，又本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種從肝癌細胞系和人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，其特征在于它包括以下步驟 (a)將0V6單克隆抗體與含有肝癌起始細胞的肝癌細胞系混合，形成“0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞”復合物； (b)離心去除未結合的0V6單克隆抗體，形成“0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞”復合物沉淀，并與磁珠標記的抗小鼠IgGl第二抗體孵育，形成“ 0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞-肝癌起始細胞”復合物； (c)通過磁場分離步驟(b)形成的復合物，從而獲得肝癌起始細胞。2.根據權利要求I所述的ー種從肝癌細胞系和人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，其特征在于，其中的肝癌細胞系是SMMC7721、Huh7、HepG2或HCC-LM3。3.根據權利要求I所述的ー種從肝癌細胞系和人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，其特征在于，它包括以下步驟 (a)將0V6單克隆抗體與從原代肝癌標本中分離的肝癌細胞混合，形成“0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞”復合物； (b)離心去除未結合的0V6單克隆抗體，形成“0V6單克隆抗...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王紅陽，楊文，于樂興，唐亮，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第二軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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