稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記及其方法與應用技術

本發明專利技術公開一種稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記及其方法與應用。該分子標記由Piks-1FNP、Piks-2FNP和Piks-3FNP組成，分別由引物對SEQID?NO.1和SEQ?ID?NO.2，SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4以及SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6從水稻總DNA中擴增出來的核苷酸序列。本發明專利技術通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pik-s的等位基因序列與Piks-1及Piks-2序列做比對的方法，分析得到能區別于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-s功能特異性的3個單堿基差異，再通過設計，得到前述引物，對水稻DNA擴增，分別得到Pik-s功能特異性分子標記Piks-1FNP、Piks-2FNP和Piks-3FNP。本發明專利技術可在大量的水稻種質資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉基因育種中的得到應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于農業生物
，特別涉及一種稻瘟病抗性基因Pik-S功能特異性分子標記PiksFNP及其方法與應用。
技術介紹
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是對水稻生產危害最嚴重的病害之一,每年都造成嚴重的糧食損失。從環境保護與農業可持續發展的觀點來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。傳統的水稻抗性育種依賴于抗性表型的鑒定，這不僅要求育種者必須具備豐富的接種、調查經驗，而且還容易受到環境以及人為因素的影響，鑒定結果容易造成誤差，目標基因的選擇效率往往較低。隨著分子標記技術的產生以及利用，其方便、直接、不受環境影響等優點使得該技術的應用價值及前景越來越受到關注。在育種方面，通過開發與目標基因緊密連鎖的分子標記，特別是在基因內部開發其功能特異性的分子標記來對目標基因進行選擇，不僅選擇可靠性高，而且還大大加快了育種步伐。由于位于第11染色體長臂端上的Pik位點含有5個具有不同抗譜以及小種特異性的等位基因Pik-m、Pik、Pik-p、Pik-h以及Pik_s，因此該位點一直是稻瘟病抗性的研究熱門。其中，Pik-m(Ashikawa et al. 2008. Two adjacent nucleotide-bindingsite—leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific riceblast resistance. Genetics 180 :2267-2276)、Pik(Zhai et al. 2011. The isolation andcharacterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication. New Phytologist 189:321-334)以及Pik_p(Yuan et al. 2011. The Pik-presistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linkedCC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet 122:1017-1028)已被成功地鑒定并克隆。研究表明，這3個等位基因的稻瘟病抗性須由2個相鄰的NBS-LRR類抗病基因共同介導。同時，在水稻群體中，包含這3個等位基因的基因組區域存在著基因型的分化，即當相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因同時存在時，該基因型被定義為K型；而當相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因同時不存在時，該基因型被定義為N型(基因型與感病水稻參考品種日本晴的相同)。申請人:在Pik-s的精細定位過程中發現，在包含Pik-s位點的基因組區域中，Pik-s供體品種 Shin 2 (Wang et al. 2009. Characterization of rice blast resistancegenes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus. Phytopathology 99 900-905)與Pik-m，Pik以及Pik-p的供體品種具有相似的基因組結構，即與參考序列日本晴之間存在著大片段的插入/缺失。進一步的功能互補實驗結果證明了 Pik-s與Pik-m、Pik、Pik-p是真正的等位基因(申請人未發表數據)。為了加快Pik-s在抗病育種工作中的應用，如在大量的水稻種質資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標記輔助選擇育種、抗性基因Pik-s與其他功能基因的聚合育種、以及轉基因育種中的應用，開發出準確有效且區別于其它等位基因的Pik-s功能特異性分子標記顯得尤其重要。
技術實現思路
為了克服現有技術的不足和缺點，本專利技術的首要目的是提供一種稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP。本專利技術的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP的檢測方法。 本專利技術的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP的應用。本專利技術目的通過以下技術方案實現一種稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP，它由Piks-IFNP、Piks-2FNP 和 Piks-3FNP 組合而成，分別由引物對 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2，SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4以及SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6從水稻總DNA中擴增出來的核苷酸序列，并經特異性酶切之后，與稻瘟病抗性基因Pik-s呈特異性帶型的分子標記；所述引物對的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. 1(5’ _3’)GTCCTACGACCTGGATGATG ；SEQ ID NO. 2(5，_3，) CAGAGAAGCGATTGGAGGCA ；SEQ ID NO. 3(5’ _3，) TAGACGAGCAAGTCCCTGA ；SEQ ID NO. 4(5’ _3，) GCAAAGTTTACTCCAATCGC ；SEQ ID NO. 5(5，_3，) TTTCTGGAGGTCAGCCGAT ；SEQ ID NO. 6(5’ -3’ ) CAACCGTTGTTTTGCCTCC ；優選的，所述的水稻品種為Shin 2 ；所述的稻瘟病抗性基因Pik-s包括2個編碼NBS-LRR類蛋白的基因Piks-I和Piks-2。所述的特異性酶切指的是由引物對SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2擴增得到的PCR產物通過限制性內切酶SphI酶切；由引物對SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4擴增得到的PCR產物通過限制性內切酶Nco I酶切；由引物對SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6擴增得到的PCR產物通過限制性內切酶Spe I酶切。所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP的檢測方法，通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pik-s的等位基因序列與Piks-I及Piks-2序列做比對的方法，分析得到能區別于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-s功能特異性的3個單喊基差異(single nucleotide polymorphism, SNP),再通過設計分別得到 SEQ ID NO. I和 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 以及 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 引物，對水稻DNA擴增，并經特異性酶切之后，分別得到Pik-s功能特異性分子標記Piks-IFNP、Piks-2FNP和Piks-3FNP，優選包括以下步驟(I)通過常規PCR法擴增，獲得多個K型水稻品種的Pik-s等位基因的編碼區DNA序列；(2)將步驟(I)所獲得的序列比對，得到Pik-s抗性基因所特異的3個功能特異性單堿基差異 Piks-ISNP、Piks-2SNP 和 Piks_本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種稻瘟病抗性基因Pik-S功能特異性分子標記PiksFNP，其特征在于它由Piks-IFNP, Piks-2FNP 和 Piks_3FNP 組合而成；分別通過引物對 SEQ ID NO. I 和 SEQ IDNO. 2，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4，以及 SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6，分別從水稻總 DNA 中擴增出來核苷酸序列Piks-lFNP、Piks-2FNP和Piks_3FNP，并經特異性酶切之后，與稻瘟病抗性基因Pik-s呈特異性帶型的分子標記；所述引物對 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4，以及 SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 6的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I :5’ -GTCCTACGACCTGGATGATG-3’ ；SEQ ID NO. 2 :5’ -CAGAGAAGCGATTGGAGGCA-3’ ； SEQ ID NO. 3 :5’ -TAGACGAGCAAGTCCCTGA-3’ ；SEQ ID NO. 4 :5’ -GCAAAGTTTACTCCAATCGC-3’ ；SEQ ID NO. 5 :5’ -TTTCTGGAGGTCAGCCGAT-3’ ；SEQ ID NO. 6 :5’ -CAACCGTTGTTTTGCCTCC-3’。2.根據權利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP，其特征在于所述的水稻為水稻品種Shin 2。3.根據權利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP，其特征在于所述稻瘟病抗性基因Pik-s包括2個編碼NBS-LRR類蛋白的基因Piks-I和Piks-2。4.根據權利要求I 3任一項所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP的檢測方法，其特征在于通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pik-s的等位基因序列與Piks-I及Piks-2序列做比對的方法，分析得到能區別于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-s功能特異性的3個單堿基差異，再通過設計分別得到SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4，以及 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6，對水稻 DNA擴增，分別得到Pik-s功能特異性分子標記Piks-lFNP、Piks-2FNP和Piks_3FNP，組合得到稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP。5.根據權利要求4所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特異性分子標記PiksFNP的方法，其特征在于包含了以下步驟 (1)通過常規PCR法擴增，獲得多個K型水稻品種的Pik-s等位基因的編碼區DNA序列； (2)將步驟⑴所獲得的序列比對，得到Pik-s抗性基因所特異的3個功能特異性單堿基差異 Piks-ISNP、Piks-2SNP 和 Piks_3SNP ； (3)根據步驟(2)所得到的3個SNP，分別設計出引物對SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4以及SEQ ID NO 5和SEQ IDNO :6，并用這3組引物對稻瘟病抗性水稻總DNA進行PCR擴增反應，分別得到擴增產物A、擴增產物B和擴增產物C ;然后分別對擴增產物進行酶切、電泳，比較驗證，分別得到與稻瘟病抗性基因Piks呈特異性帶型的核苷酸片段 Piks-IFNP、Piks-2FNP 和 Piks_3FNP ； (4)對步驟(3)所獲得的分子標記在不同水稻品種中進行驗證，從而確定Pik-s抗性基因的功能特異性的分子標記PiksFNP，該分...

【專利技術屬性】
技術研發人員：潘慶華，陳彩霞，翟純，林菲，王玲，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：