本發明專利技術公開了甲型肝炎病毒基因組保守區來源的甲型肝炎病毒特異性的引物和探針。本發明專利技術還公開了利用捕捉寡核苷酸、引物和探針的核酸分析方法。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及病毒診斷領域。更具體地說，本專利技術涉及準確診斷甲型肝炎病毒感染和檢測生物樣品中甲型肝炎病毒的核酸分析方法。
技術介紹
甲型肝炎是ー種腸道傳染病，可引起發熱、不適、食欲缺乏、惡心、腹部不適及黃疸。引起甲肝的原因是甲肝病毒感染，這是ー種小的無包膜的球形病毒，屬于小核糖核酸病毒科肝炎病毒屬。HAV基因組由一條單鏈線性RNA分子組成，長度為7. 5kb，其編碼的多聚蛋白前體經處理后形成結構蛋白并具有病毒復制所需要的酶活性(Najarian等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2627-2632(1985))。HAV 在細胞培養物中生長狀況差，產生的病毒數很少，不能引起細胞病變。雖然從病毒顆粒中提取的HAV RNA可以感染細胞培養物(Locarnini 等，J. Virol. 37 :216-225(1981)和 Siegl 等，J. Gen. Virol. 57 331-341 (1981))，但是直接對病毒基因組進行操作比較困難，因為病毒基因組是由RNA構成的。HAV編碼4種衣殼蛋白(A、B、C和D)，這些蛋白含有能被感染個體的抗體識別的主抗原性結構域。除了衣殼蛋白以外，也有報道證明在結構蛋白如2A和病毒編碼蛋白酶中也存在抗原性結構域。其他重要的HAV抗原性結構域位于衣殼蛋白前體Pl和2A之間的連接處。HAV通常是由糞-ロ途徑傳播的，通過人與人的接觸或攝入被污染的食物或水而感染。但是，輸入血漿產物也可能是HAV的傳播途徑。由于缺乏脂質包膜，因此HAV很難通過物理化學方法滅活，而且能夠耐受常規的血制品加熱消毒。和細小病毒B19 —祥，HAV也可以通過輸入血漿衍生物進行傳播。開發敏感的高特異診斷方法來鑒定感染個體內HAV抗原和/或抗體的以及開發核酸檢測方法來檢測病毒血樣以避免其傳播是公共衛生領域一大課題。Robertson等人的美國專利No. 5，290，677描述了利用抗體捕捉完整HAV病毒的方法。分離RNA，制備其cDNA。然后用根據HAV基因組上VPl和VP3衣殼區的引物PCR擴增該cDNA，擴增出的產物用根據基因組同一區的探針進行檢測。引物和探針的選擇根據所要檢測的HAV的基因型來確定。目前，仍然需要開發出ー種可靠的診斷試驗方法來檢測病毒血樣中的甲肝病毒，以避免病毒通過血液或血漿衍生物傳播，或者通過人與人之間的近距離接觸傳播。專利技術概述本專利技術的目的在于開發出一種靈敏可靠的核酸診斷方法用于檢測潛在感染個體、來源的生物樣品中的HAV。本文所描述的方法用樣品中提取的核酸作為模板通過PCR、轉錄介導的擴增(TMA)以及5’核酸酶法如TaqMan 技術來擴增HAV序列上的保守基因組區。這些方法可檢測病毒血樣中的HAV。在某些實施方式中，本專利技術利用據HAV基因組5’ UTR區設計的引物和探針。另外，本專利技術的方法還可實現ー鍋化分析(one-pot analysis),即捕獲的樣品核酸可在ー個容器內擴增和檢測。利用本專利技術的方法可鑒定被感染的樣品，避免被感染的樣品被輸入以及避免這些感染的樣品被制成血液衍生物。 因此，在一個實施方式中，本專利技術提供了一種檢測樣品中HAV感染的方法，該方法包括(a)在高離液鹽濃度下或適于固相支持物與靶核酸序列形成復合物的雜交條件下使生物樣品與固相支持物接觸；(b)從樣品中分離(a)步驟后的固相支持物；(c)擴增可能存在的靶核酸序列；以及(d)檢測擴增的靶核酸序列，其存在表明樣品中存在HAV。在另ー個實施方式中，本專利技術提供了一種檢測生物樣品中HAV感染的方法，該方法包括(a)在高離液鹽濃度下或適于固相支持物與靶核酸序列形成復合物的雜交條件下使生物樣品與固相支持物接觸；(b)從樣品中分離(a)步驟后中的固相支持物；以及(c)利用據HAV基因組5’ UTR設計的引物例如具有SEQ ID NOs :1和2所示的序列的引物，擴增靶核酸鏈。在某些實施方式中，該方法還包括利用根據HAV基因組5’UTR的探針例如SEQ ID NOs :3所示探針檢測被擴增的靶核苷酸以判斷樣品中是否存在HAV的步驟。在另ー個實施方式中，本專利技術提供了一種檢測生物樣品中HAV感染的方法，該方法包括從懷疑含有HAV的生物樣品中分離核酸；用至少兩個引物擴增核酸，其中，(a)每個引物的長度都不超過約60個核苷酸，弓I物之一含有SEQ ID NOs :1中的至少10個連續核苷酸，另ー個引物含有SEQ ID N0s:2中的至少10個連續核苷酸，或者，(b)引物序列與(a)所述核苷酸序列具有90%的一致性，其中兩個引物分別所述分離核酸的正義鏈和反義鏈的部分序列具有足夠的互補性以與之雜交；以及檢測擴增的核酸，如有擴增的核酸則表明樣品中存在HAV。在某些實施方式中，如下從生物樣品中分離核酸(a)使含捕捉核酸的固相支持物與生物樣品在雜交條件下接觸使靶核酸鏈與捕捉核酸雜交；以及(b)從樣品中分離固相支持物。在另外的實施方式中，分離、擴增和檢測是在ー個容器內進行的。在另外ー個實施方式中，捕捉核酸含有ー種或多種寡核苷酸，其中姆種的長度都不超過 60 個核苷酸并含有選自 SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 5,SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :7的序列中的至少10個連續核苷酸。另ー實施方式中，捕捉核酸還包含長度約為15-25個核苷酸的一段同聚物鏈，如聚A、聚T、聚G、聚C或聚U。在另外的實施方式中，擴增方法包括PCR、轉錄介導的擴增(TMA)或TaqMan。在另外ー個實施方式中，本專利技術的方法還包括利用標記的寡核苷酸探針檢測擴增產物的步驟，探針的長度不超過約60個核苷酸并含有SEQ ID NO :3所示序列中的至少10個連續核苷酸。在某些實施方式中，探針在其5’末端和3’末端還含有可檢測的標記物，如選自以下的熒光標記物6_羧基熒光素(6-FAM)、四甲基羅丹明(TAMRA)和2’，4’，5’，7’，-四氯-4-7- ニ氯熒光素(TET)。在其他的實施方式中，本專利技術提供了一種檢測生物樣品中HAV感染的方法，該方 法包括(a)使固相支持物與含一種或多種寡核苷酸的捕捉核酸接觸，所述ー種或多種寡核苷酸含有選自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13 和 SEQ IDNO 14的序列，接觸在能使捕捉核酸連接到固相支持物上的條件下進行，(b)使固相支持物與生物樣品在雜交條件下接觸使樣品中可能存在的HAV來源的靶核酸鏈與捕捉核酸雜交；以及(C)從樣品中分離步驟(b)后的固相支持物；(d)用含SEQ ID NO 1的正向引物和含SEQ ID NO 2的反向引物擴增核酸，其中正向引物和反向引物分別與分尚核酸的正義鏈部分和反義鏈的部分序列充分互補以與之雜交；以及(e)檢測擴增的靶核酸序列以判斷樣品中是否存在HAV。在上述方法的某些實施方式中，固相支持物包括小珠，如磁珠，核酸的分離、擴增和檢測在ー個容器內進行。在另外的實施方式中，本專利技術提供了ー種寡核苷酸，該寡核苷酸包含任ー圖I所示的核苷酸序列。 在其他的實施方式中，本專利技術提供了一種長度不超過60個核苷酸的分離的寡核苷酸，該寡核苷酸包含(a)具有選自SEQ ID NOs :1、2和3的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
2002.06.12 US 60/388,5441.一種長度不超過60個核苷酸的游離寡核苷酸，包含 (a)具有選自SEQID NOs :1、2和3的序列中至少10個連續核苷酸的核苷酸序列； (b)與(a)的核苷酸序列有90%—致性的核苷酸序列；或者 (c)(a)和(b)的互補序列。2.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中的寡核苷酸是具有選自SEQID N0s:l、2和3的序列中至少10個連續核苷酸的核苷酸序列。3.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中的核苷酸序列含有SEQID N0:1。4.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中的核苷酸序列含有SEQID N0:2。5.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中的核苷酸序列含有SEQID NO :3。6.如權利要求5所述的寡核苷酸，該寡核苷酸在其5’和/或3’末端還含有可檢測標記物。7.如權利要求6所述的寡核苷酸，其中的可檢測標記物是選自下列一組的熒光標記物6_羧基熒光素(6-FAM)、四甲基羅丹明(TAMRA)和2’，4’，5’，7’，-四氯_4_7_ 二氯熒光素(TET)。8.用于擴增甲型肝炎病毒核酸的一對引物，所述的引物對分別由含SEQIDNO :1和SEQID NO 2的引物構成。9.一種檢測生物樣品中甲型肝炎病毒(HAV)的方法，該方法包括 從懷疑含有HAV的生物樣品中分離核酸； 用至少兩個來源于HAV基因組5’ UTR區的引物擴增所述分離核酸，其中每個引物的長度為10-60bp，并且分別與所述分離核酸的正義鏈和反義鏈的部分序列具有足夠的互補性以與之雜交；以及 檢測擴增的核酸，如有擴增的核酸則表明樣品中存在HAV。10.如權利要求9所述的方法，其中，(a)引物之一含有SEQID NO 1中的至少10個連續核苷酸，另一個引物含有SEQ ID NOs :2中的至少10個連續核苷酸，或者(b)引物序列與(a)所述核苷酸序列具有90%的一致性；以及 檢測擴增的核酸，如有擴增的核酸則表明樣品中存在HAV。11.如權利要求9所述的方法，其中，將核酸從生物樣品中分離的方法包括 (a)使結合了含捕捉核酸的固相支持物與生物樣品在雜交條件下接觸使靶核酸鏈與捕捉核酸雜交；以及 (b)從樣品中分離固相支持物。12.如權利要求11所述的方法，其中的固相支持物包含小珠。13.如權利要求12所述的方法，其中的小珠是磁珠。14.如權利要求13所述的方法，其中分離、擴增和檢測在一個容器內進行。15.如權利要求11所述的方法，其中的捕捉核酸含有一種或多種寡核苷酸，其中每種寡核苷酸的長度都不超過60個核苷酸并含有選自SEQ ID NO 10, SEQ IDNO =IUSEQ ID NO.12、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的序列中的至少10個連續核苷酸。16.如權利要求15所述的方法，其中的捕捉核酸在其3’或5’端還含有一個約15-25個核苷酸的同聚物鏈，所述同聚物鏈選自 聚A、聚T、聚G、聚C和聚U。17.如權利要求16所述的方法，其中的同聚物鏈是聚A鏈。18.如權利要求9所述的方法，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：V·石亞馬拉，
申請(專利權)人：諾華疫苗和診斷公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。