本發明專利技術公開了黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態性及其檢測方法，其基因單核苷酸多態性包括：以包含I-mfa基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛I-mfa基因，對擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據電泳結果鑒定黃牛I-mfa基因第12284位為A或G的堿基多態性；在黃牛的I-mfa基因第12331位為T或C的堿基多態性；這兩個位點完全連鎖。本發明專利技術是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長性狀密切相關的分子遺傳標記，為利用雜種優勢進行黃牛雜交育種提供了分子依據。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子遺傳學領域，涉及以黃牛的功能基因的單核苷酸多態性(SNP)作為分子遺傳標記，特別涉及。
技術介紹
黃牛是我國的主要的家畜之一，但是現在面臨著優秀黃牛品種種源不足和種群遺傳品質較差的壓力。傳統的育種方法應用測試動物的表現型和其親代、祖代及其它親屬在小動物模型中的遺傳信息，設想性狀受到許多基因遺傳差異的影響，每個基因對性狀有相對較小的貢獻，因此對性狀的估計不可避免有些偏差。分子遺傳標記是近年來現代遺傳學發展最快的領域之一，新的方法正在不斷涌現，已定位的標記基因數目與日俱增。這將為數 量遺傳學提供了分子水平信息，家畜育種也將跨入分子育種階段。應用分子遺傳標記的現代育種技術是加快良種選育和提高種群遺傳品質，從而増加黃牛的產肉量和改善肉品質的先進的有效的方法。分子遺傳標記輔助選擇就是將現代生物技術與常規選擇方法相結合，通過對遺傳標記的選擇來間接選擇控制某性狀的數量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標記位點信息和數量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。標記輔助選擇主要經歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(酶)標記對數量性狀的標記階段；第三個階段是分子遺傳標記階段。隨著分子標記技術日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現分子標記輔助選擇的目標。單核苷酸多態性(singlenucleotide polymorphism, SNP)就是指基因組 DNA 序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性。因此，通常所說的SNP包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數的變化。ー個SNP表示在基因組某個位點上有ー個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起；具有轉換型變異的SNP約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用于基因定位、克隆、遺傳育種及多祥性的研究。SNP是基因組中存在的ー種數量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態性的90%以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1%的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1%時才被稱為單核苷酸多態性。目前，主要采用幾種不同的方法來發現SNPs =DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技術與分子信標(molecular beacons)等。在這些SNP檢測技術中，(I)DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術人員和經驗，所以，DNA序列測定法不是ー種應用于生產實際的理想SNP檢測方法；(2) PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；(3) AS-PCR方法作為ー種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同吋，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；(4)TaqMam技術與分子信標(Molecular Beacons)都是在突光能量轉移(fluorescence resornance energ transfer,FRET)基礎上建立起來的，利用熒光標記及儀器達到檢測目的。焦磷酸測序(pyrosequencing)則是利用測序過程中可釋放的焦磷酸和酶類產生熒光，是不依賴平板膠或毛細管電泳、不依賴DNA的熒光標記技術，很可能成為未來的主流技術。(5) RFLP-PCR方法是ー種檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點后引入限制性內切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。 I-mf (inhibitor of MyoD family)是一種生肌因子MyoD家族的抑制物，又稱MDFI (MyoD family inhibitor),它能直接與MyoD家族成員相互作用，如MyoD, myf5,myogenin and MRF4。Inf基因最早是1996年由C. _M. Amy Chen等在小鼠胚胎的實驗中發現并分離的。和MyoD家族成員主要存在于生肌節不同，I-mfa主要在生骨節高度表達。I-mf基因位于人6號染色體短臂上，全長15kb，有5個外顯子和4個內含子，編碼246個氨基酸。小鼠I-mf基因定位于17號染色體上，全長19kb，有5個外顯子和4個內含子。cDNA編碼三種蛋白質，I-mfa，I-mfb和I-mfc。牛的I_mf基因位于23號染色體上，全長17kb，具有5個外顯子和4個內含子，編碼247個氨基酸。轉錄產物也有三種亞型I-mfa，I-mfb和I-mfc。它們具有相同的氨基末端,在羧基端卻有很大差異,致使只有I-mfa能與MyoD家族相互作用。I-mfa通過獨特的羧基末端直接和MyoD家族成員共有的bHLH域結合，從而阻止MyoD家族成員與相關DNA結合,并I_mfa通過掩蓋MyoD家族成員的核定位信號進而達到抑制MyoD家族轉錄活性的作用。近幾年ー些研究人員發現，I-mfa不僅可以抑制與肌形成相關的MyoD家族成員的轉錄活性，其對ー些和骨骼形成相關的蛋白也有影響，如Zic家族蛋白。I-mfa的生理功能主要體現在對骨骼和肌肉形成的抑制作用上，對于它的作用機制，近年來也有進展。I-mfa與TRPCl結合，作為分子開關抑制依賴電流的TRPCl通道；此外，通過參與fct信號通路達到抑制肌肉形成分化的目的。2006年，Pan等發現I-mfa介導的對LEF-I的抑制作用能夠被連環蛋白解除，這為其作用機制提供有力的證明。2008年Kim等發現對于調節肌肉發育的Wnt信號通路來說，β -連環蛋白是必需的，可與MyoD直接結合并增加它的活性。這些表明I-mfa在參與Wnt信號途徑中和MyoD及β-連環蛋白起著相互調控的作用，這為正常進行肌肉分化提供了基礎。我們可以預見，如果I-mfa基因發生突變，將有可能對I-mfa的結構產生影響從而影響其生理活性，解除對MyoD的抑制作用，促進肌肉的生長發育。關于動物I-mfa基因的研究國內外多見于人、鼠等動物，對黃牛I_mfa基因遺傳變異或SNP研究的報道還未見報道。由于目前黃牛I-mfa基因遺傳變異領域的研究匱乏，使該基因位點的功能研究及該基因遺傳變異與經濟性狀(如生長發育性狀)關聯的研究成為空白
技術實現思路
本專利技術解決的問題在于提供黃牛I-mfa基因單核苷酸多態性檢測方法及其應用，尋找與黃牛經濟性狀相關的SNP作為分子標記，加快黃牛良種繁育速度。本專利技術通過以下技術方案來實現黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態性位點，其中，該基因單核苷酸多態性位點包括黃牛I-mfa基因第12284位為A或G的單核本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態性位點，其特征在于，該基因單核苷酸多態性位點包括 黃牛I-mfa基因第12284位為A或G的單核苷酸多態性位點；和 黃牛I-mfa基因第12331位為T或C的單核苷酸多態性位點。2.黃牛I-mfa基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、以包含I-mfa基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛I-mfa基因； 所述的引物對P為 上游引物 Pl TTCTCCTCCATCGCCCTTTTC ； 下游引物 P2 ATGCTGCTGCCGCTCCCT ； (2)、對步驟(I)的擴增產物進行PCR產物的切膠回收及純化、測序； (3)、對步驟(2)的純化產物進行PCR-SSCP檢測首先對純化的PCR產物用變性劑進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳宏，李景景，張春雷，房興堂，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：
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