STAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記及其應用制造技術

本發明專利技術屬于家畜分子標記制備技術領域，具體涉及一種STAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記及其應用，從牛STAT4基因中克隆獲得一種作為分子標記應用的與牛乳質性狀相關的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，在SEQ?ID?NO：1的146bp處有一個G146-A146的堿基替換，280bp處有一個G280-C280的堿基顛換。所發現的G146-A146的堿基替換和280bp處G280-C280的堿基顛換為2個單核苷酸連鎖突變，因此這2個突變僅出現GGGG、GAGC和AACC這3種單倍型。本發明專利技術有益的效果：公開了擴增STAT4基因部分內含子區所用的引物以及用于分子標記的檢測方法。本發明專利技術為牛的標記輔助選擇提供了2個新的分子標記。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及牛的分子標記輔助選擇
，尤其是一種STAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記及其應用。
技術介紹
作為奶牛生產重要的經濟性狀，乳質性狀主要包括乳蛋白量、乳蛋白率、乳脂量和乳脂率等方面，屬典型的微效多基因控制的數量性狀，可直接影響牛奶的營養、風味和牛奶產業的經濟效益。雖然正常情況下乳成分基本保持穩定，但乳脂和乳蛋白等成分會因生理和遺傳因素在一定范圍內產生波動并影響乳 品質，因此亟需依據市場和人類營養學的需求，利用功能基因和功能性單核苷酸多態性分子標記改善牛奶品質。哺乳動物的信號轉導與轉錄激活因子(signal transduction and activator oftranscriptions, STATs)家族介導了多種生物學反應，可與酪氨酸磷酸化信號通路偶聯，直接聯系細胞外信號、參與目的基因表達調控，從而調控包括細胞生長、分化、凋亡及免疫反應等多種重要的生物過程。作為Jak蛋白酪氨酸激酶(Janus protein tyrosine kinase,JAK)的靶蛋白，在哺乳動物中已發現7種STAT蛋白，即STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。與其他STAT蛋白不同，STAT4是STAT蛋白家族中惟一限定組織分布的成員，主要分布在淋巴和髓系組織中。該蛋白主要由IL-12激活，在Thl/Th2的分化調控及因此失調引發的各種炎癥性疾病中發揮著重要的作用。目前的研究顯示乳腺組織中可檢測到除STAT2外的其他6種STAT蛋白，且乳腺發育過程中的STAT蛋白以STAT1-STAT4-STAT6-STAT5-STAT3-STAT1的方式被連續激活，每個成員均在該過程中發揮各自特有的功能。在乳腺發育過程中，STAT4基因的表達存在變化，雖然人們尚不確定STAT4在乳腺發育過程中的特定功能，但是該蛋白與乳腺發育過程密切相關。另外，在該基因內已經發現了存在與牛乳質性狀相關的分子標記。因此，申請人開展了牛STAT4基因內含子19序列的克隆、SNP篩查與檢測及其與牛乳質性狀的關聯分析。
技術實現思路
本專利技術的目的正是要解決上述技術存在的不足，而提供一種STAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記及其應用，一種作為牛標記輔助選擇的、與牛乳質性狀相關的分子標記的克隆及應用，本專利技術的分子標記與STAT4基因有關。本專利技術目的在于克隆與牛乳質性狀相關的分子標記，利用該分子標記作為牛標記輔助育種的應用。本專利技術解決其技術問題采用的技術方案本專利技術克隆得到一種與牛乳質性狀相關的分子標記，它是序列表SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。在序列表SEQ ID NO 1的146bp處有一個G146-A146的堿基替換，280bp處有一個G280-C280的堿基顛換。所發現的G146-A146的堿基替換和280bp處G280-C280的堿基顛換為2個單核苷酸連鎖突變，因此這2個突變僅出現GGGG、GAGC和AACC這3種單倍型。其中克隆牛STAT4基因的引物對的DNA序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所本專利技術建立一種制備上述分子標記和檢測上述分子標記的方法，該方法的步驟如下用牛STAT4基因設計引物，擴增得到目的片段；從牛外周血中提取基因組DNA，以牛STAT4基因DNA序列為模板設計引物，PCR擴增，PCR產物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，應用PCR-SSCP方法檢測牛STAT4基因的多態性，并初步進行了其基因型與牛乳質性狀之間的關聯分析的應用，為牛的分子標記輔助選擇提供了一個新的分子標記。本專利技術有益的效果是從牛STAT4基因中克隆獲得一種作為分子標記應用的與牛乳質性狀相關的基因片段，公開了擴增STAT4基因部分內含子區所用的引物以及用于分子標記的檢測方法。本專利技術為牛的標記輔助選擇提供了 2個新的分子標記。附圖說明圖I :是本專利技術的技術流程圖。圖2:是本專利技術中牛STAT4基因內含子19擴增序列的電泳圖譜，片段大小為310bp (瓊脂糖膠濃度為1.5% )0圖中M為DNA分子量標記(DL2000plus)。圖3 :中國荷斯坦奶牛STAT4基因內含子19突變純合型BB基因型個體序列的與牛全基因組數據庫BLAST比對結果。圖4:是本專利技術中牛STAT基因內含子19突變純合型個體測序發現SEQ ID N01的146bp處有一個G146-A146的堿基替換，280bp處有一個G280-C280的堿基顛換，兩個突變為兩個單核苷酸連鎖突變。圖5 :是本專利技術中牛STAT4基因內含子19PCR-SSCP的3種基因型(AA、AB和BB各對應146bp處和280bp處GGGG、GAGC和AACC這3種基因型。)具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本專利技術作進一步說明序列表SEQ ID NO 1是本專利技術克隆及用于PCR-SSCP檢測的牛乳質性狀相關基因STAT4基因內含子19的DNA序列。序列表SEQ ID NO 2是本專利技術中用于克隆及PCR-SSCP檢測牛乳質性狀相關基因STAT4基因內含子19DNA突變的PCR-SSCP上游引物。序列表SEQ ID NO 3是本專利技術中用于克隆及PCR-SSCP檢測牛乳質性狀相關基因STAT4基因內含子19DNA突變的PCR-SSCP下游引物。實施例I :STAT4基因內含子19序列的克隆(制備實施例)I.引物設計利用牛STAT4基因DNA序列(GenBank收錄號NC 007300. 5)設計了一對用于擴增牛STAT4內含子19的引物。引物由美國Invitrogen英杰生命技術有限公司上海辦事處合成，引物對的DNA序列如下正向引物5'-GAGCGGTTAGTAATCAGTAGCTAGA-3'(對應 SEQ ID NO :2)，反向引物5'-GGAGGGGATGAAGCATAAAGACC-3'(對應 SEQ ID NO :3)。2. PCR產物的擴增、純化和測序(I) PCR 擴增25 μ L 的反應體系中加入 50ng/y L 的 DNA 模板 2 μ L，10XPCR Buffer 2. 5 μ L,2.5mMdNTP I μ L，IOmM正、反向引物各0. I μ L，Taq酶1U，雙蒸水至25 μ L。PCR反應程序如下94°C預變性 5min ;94°C變性 10sec，6rC復性 10sec，72°C延伸 20sec，35 個循環；72°CIOmin ;4°C保存。PCR產物經I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)。、(2) PCR產物的純化和測序足量的PCR產物經I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，在瓊脂糖凝膠中切割分子量為310bp的目的片段,利用E.Z.N.A8.膠回收試劑盒(Omega)進行純化后,送美國Invitrogen英杰生命技術有限公司上海辦事處進行測序。(3) DNA序列同源性檢索鑒定及突變位點的確定通過NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，將測序后獲得的序列與GenBank牛全基因組數據庫中公布的數據進行比對，結果顯示克隆的序列位于牛STAT4基因內含子19(圖3)。而該基因在2個位點發生了基因突變。這2個位點分本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種STAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記，其特征在于其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示，在序列表SEQ ID NO 1的第146bp處有一個G146-A146的堿基替換，序列表SEQ ID NO 1的第280bp處有一個G280-C280的堿基顛換。2.根據權利要求I所述的TAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記，其...

【專利技術屬性】
技術研發人員：宋雪梅，蔣永清，張磊，姜俊芳，
申請(專利權)人：浙江省農業科學院，
類型：發明
國別省市：