一種快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，它能從特定細(xì)菌發(fā)酵液中快速去除其中的污染物，包括蛋白和核酸，保留純化的莢膜多糖，包括含莢膜多糖細(xì)菌的發(fā)酵，加酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值沉淀發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，采用離心分離、微濾、超濾濃縮和洗濾獲得粗制細(xì)菌莢膜多糖溶液。本發(fā)明專利技術(shù)的基本原理是通過加酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3-5的范圍，以去除形態(tài)完整的菌體以及其它雜質(zhì)，保持莢膜多糖在溶液中來進(jìn)行純化。可用于純化肺炎球菌、b型流感嗜血桿菌、流行性腦膜炎球菌以及傷寒桿菌的莢膜多糖。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種能夠從細(xì)菌發(fā)酵液中去除污染物，純化莢膜多糖的方法
技術(shù)介紹
肺炎球菌，b型流感嗜血桿菌，流行性腦膜炎球菌以及傷寒桿菌是威脅人類生命的重要致病菌。開發(fā)疫苗來預(yù)防這些病菌的感染是醫(yī)學(xué)界多年奮斗的目標(biāo)。自上世紀(jì)60年代，通過實(shí)驗(yàn)手段發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌有一個(gè)共同的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，就是細(xì)胞膜表面包裹著一層莢膜，這層莢膜是由多糖包裹在每一個(gè)細(xì)胞膜表面形成，故稱莢膜多糖。在人體內(nèi)，莢膜對(duì)于這些細(xì)菌致病性起著決定性作用，因?yàn)椋ㄟ^防止抗體吸附到細(xì)菌膜上，莢膜能夠干擾免疫細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬作用，使得細(xì)菌能夠在體內(nèi)繁殖而致病。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌莢膜多糖作為疫苗具有很好的免疫原性，可以刺激具有健全的免疫功能的成人產(chǎn)生抗體來抵抗具有莢膜多糖細(xì)菌的感染；但是，由于2歲以下兒童的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，對(duì)莢膜多糖沒有免疫應(yīng)答，而這一人群是受這些致病菌威脅最為嚴(yán)重人群，開發(fā)能夠保護(hù)這一人群的疫苗是醫(yī)學(xué)界的重點(diǎn)課題。自上世紀(jì)80年代，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)莢膜多糖以共價(jià)鍵和蛋白質(zhì)結(jié)合，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素或者CRM197 (變異白喉無毒毒素)后，形成多糖-蛋白結(jié)合疫苗，可在2歲以下嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)于莢膜多糖的免疫應(yīng)答反應(yīng)，自此，一種以細(xì)菌莢膜多糖聯(lián)接至蛋白載體的合成疫苗誕生。目前，在市場上用于預(yù)防成年人肺炎球菌球菌感染的有23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗，以及預(yù)防兒童的7價(jià)、10價(jià)和13價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗在全球范圍廣泛使用。另外，傷寒(vi)多糖疫苗、b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗、4價(jià)流行性腦膜炎多糖結(jié)合疫苗也已經(jīng)應(yīng)用多年。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來看，不同的細(xì)菌具有不同的莢膜多糖，而同一種細(xì)菌不同血清型細(xì)菌也有不同的莢膜多糖，如肺炎球菌有90種不同血清型，腦膜炎球菌有A、B、C、W135和Y群，它們都具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的莢膜多糖。研究發(fā)現(xiàn)，每種莢膜多糖具有嚴(yán)格的重復(fù)性化學(xué)結(jié)構(gòu)，這個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)可由一個(gè)單糖單位或含有最多達(dá)7-8單糖殘基組成的寡聚糖組成。這種重復(fù)性單位可為線性或含有非碳水化合物取代基團(tuán)的分叉結(jié)構(gòu)，這些非碳水化合物取代基團(tuán)可為O-乙酰基(Ο-acetyl)、甘油磷酸(glycerol phosphate)或丙酮酸(pyruvate)；另外，肺炎球菌一些莢膜多糖可能含有不常見的單糖殘基，如二氨基(diamino-)，脫氧和分叉鏈糖等。這種細(xì)菌多糖結(jié)構(gòu)的多樣性，給純化這些多糖方法帶來了挑戰(zhàn)和困難。用莢膜多糖來制備疫苗，包括多糖疫苗或多糖結(jié)合疫苗，都需要用符合一定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的莢膜多糖作為原料來制備。為了獲得高純度的莢膜多糖，可用富有營養(yǎng)成分的液體培養(yǎng)液來發(fā)酵細(xì)菌，進(jìn)而從發(fā)酵液中純化莢膜多糖，純化過程中要去除的主要污染物包括細(xì)菌蛋白，核酸和培養(yǎng)基成分，如果是制備肺炎球菌莢膜多糖時(shí)，還需要控制C-多糖的污染。細(xì)菌莢膜多糖純化工藝的建立經(jīng)歷了多年的發(fā)展過程，傳統(tǒng)方法純化莢膜多糖過程中，去除多糖溶液中的核酸污染以達(dá)到疫苗制劑所需純度要求比較困難，由于不同細(xì)菌的莢膜多糖的化學(xué)特性不同，每種細(xì)菌莢膜多糖需要用特殊方法來去除核酸污染，沒有一種方法能夠純化其它細(xì)菌的莢膜多糖。有些細(xì)菌莢膜多糖需要通過大量的乙醇來進(jìn)行沉淀，同時(shí)，要用不同的有機(jī)溶劑萃取，如乙醚等，來幫助純化。乙醇沉淀通常能夠有效地去除多糖中的蛋白污染物，并將其濃度降低至比較低的水平；但是，難以降低到用于注射用的疫苗要求的水平，包括采用有機(jī)溶劑氯仿和丁醇混合溶劑或者苯酚，和多糖溶液混合，震搖4-6小時(shí)，然后，用低速離心，聚集在水相和有機(jī)相之間的變性蛋白能夠與水相中的多糖分離。不過這種方法的缺點(diǎn)是在萃取過程中，多糖會(huì)被降解，斷裂或者失去其原始空間構(gòu)象，純化出來的多糖已經(jīng)不是有效的免疫原。由于不同細(xì)菌多糖結(jié)構(gòu)的多變性限制了這些分離方法的有效性。由此，得出結(jié)論是早期的傳統(tǒng)方法中沒有一種方法能夠有效地純化不同細(xì)菌的莢膜多糖。盡管如此，有幾種純化出高純度和保存有其免疫原性的不同細(xì)菌莢膜多糖方法被專利技術(shù)，特別是在純化不同血清型肺炎球菌莢膜多糖時(shí)，這些方法能夠有效地純化出包括24種血清型莢膜多糖。包括 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并用于配制23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗的莢膜多糖原料。1980 年，美國 American Cyanamid Company 公司的專利 US4242501 闡述了一種純化肺炎球菌莢膜多糖方法，在這一專利基礎(chǔ)上，隨后該公司又于1987年注冊了另一個(gè)專利US4686102，用以純化23個(gè)不同的血清型肺炎球菌莢膜多糖。該專利的基本工藝途徑是肺炎球菌發(fā)酵后，加入脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)溶解細(xì)菌，將菌體上的莢膜多糖釋放至發(fā)酵液中，離心去除了細(xì)胞碎片后，用乙醇沉淀兩次，這一步驟能夠去除包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的大量污染物；加入十六烷基三甲基溴化銨至乙醇沉淀后的多糖溶液，進(jìn)一步去除污染物。通過控制十六烷基三甲基溴化銨濃度，能夠吸附沉淀大部分血清型多糖沉淀下來，這些沉淀多糖隨后能夠溶解于氯化鈉溶液，離心去除那些不溶解的大分子污染物。不過，有四種血清型多糖不能夠和十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀，加入十六烷基三甲基溴化銨的作用是沉淀污染物，離心去除這些污染物。隨后，再加入乙醇以去除十六烷基三甲基溴化銨。離心去除沉淀后，加入活性炭吸附殘留的污染物，如蛋白和核酸。最后，通過透析獲得純化莢膜多糖。從工藝過程可見，盡管該方法建立了一個(gè)肺炎球菌莢膜多糖的純化平臺(tái)，用同一種方法能夠純化出不同血清型多糖，但是步驟繁雜，不宜掌握；其中還包括了多步乙醇沉淀、離心，費(fèi)時(shí)，設(shè)備費(fèi)用高昂；而且不宜擴(kuò)大生產(chǎn)。十六烷基三甲基溴化銨沉淀步驟技術(shù)復(fù)雜，不同血清型處理方法不同。另外，最終純化出來的多糖僅僅能夠滿足制備23價(jià)肺炎多糖疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，即蛋白和核酸含量低于2%-7%，無法滿足現(xiàn)有的肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗對(duì)多糖原料中蛋白和核酸含量低于I%的質(zhì)量要求。至1998 年，美國 American Home Products 公司的專利 US5714354 提出了一種無乙醇沉淀來純化肺炎球菌莢膜多糖的改進(jìn)方法。該方法是通過用十六烷基三甲基溴化銨來沉淀23種肺炎球菌血清型中的20個(gè)莢膜多糖，然后用活性炭過濾、羥基磷酸灰質(zhì)鹽(Hydroxyapatite)色譜法和陰離子交換色譜法來進(jìn)一步分離多糖中的污染物,該純化工藝步驟能夠純化出大部分血清型莢膜多糖。而其它3個(gè)不能夠和十六烷基三甲基溴化銨沉淀的血清型(血清型7F、14和33F)的純化，是采用修飾方法來進(jìn)行純化，包括陰離子交換樹脂色譜法。和前一專利純化工藝比較，這一純化工藝能夠節(jié)省75%純化時(shí)間，費(fèi)用也降低，、不需要特殊設(shè)備。該方法純化出來的所有23個(gè)血清型莢膜多糖的質(zhì)量達(dá)到多糖疫苗的質(zhì)量指標(biāo)。同在1998年，美國Merck公司的專利US5847112也發(fā)布一種純化肺炎莢膜多糖的方法。基本方法為用乙醇來分兩步從發(fā)酵破菌液中分離多糖；第一步是用低百分比的乙醇來沉淀細(xì)胞碎片和污染物，如C-多糖，保留多糖于溶液中；接下來，加入高濃度的乙醇來沉淀莢膜多糖，將留在溶液中的其它污染物丟棄。將沉淀多糖溶解后，再用常規(guī)方法，比如核酸和蛋白酶消化，或者本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，包括以下步驟 步驟一，莢膜多糖細(xì)菌的發(fā)酵在裝有細(xì)菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵出特定莢膜多糖的細(xì)菌； 步驟二，加酸沉淀發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)加酸調(diào)節(jié)步驟一所得發(fā)酵液的PH值，控制PH值< 5，用此方法來沉淀菌體和雜質(zhì)； 步驟三，采用離心法去除步驟二發(fā)酵液中沉淀物，收集經(jīng)離心后的上清液； 步驟四，用微濾膜對(duì)步驟三所獲得的離心上清液進(jìn)行微濾，以去除其中的殘留細(xì)胞碎片和不溶小顆粒物質(zhì)； 步驟五，超濾濃縮和洗濾用超濾膜濃縮和洗濾步驟四的微濾液，獲得粗制細(xì)菌莢膜多糖溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，其特征是所述細(xì)菌包括肺炎球菌、b型流感嗜血桿菌、流行性腦膜炎球菌和傷寒桿菌...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李建平，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇康泰生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：