一種達托霉素的提取純化方法技術

本發明專利技術公開了一種達托霉素的提取純化方法，先將發酵液中達托霉素富集，再將富集得到的達托霉素粗提取、精制，最后凍干獲得；其中粗提取先采用酸性柱層析，再用中性柱層析；在精制時，先用中性柱層析，再用酸性柱層析。通過提取純化方法的改進，很好去除了發酵過程中產生大量的色素及與達托霉素結構相近似的同系物、異構體等副產物。本發明專利技術提取純化的最終產物純度，且工藝簡單易于工業化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬藥物化學領域，具體涉及。
技術介紹
達托霉素是一類稱為環酯肽類新抗生素家族的第一個產品。它是從小鏈霉菌{Streptomyces parvus)發酵液當中提取得到的十三個氨基酸組成的結構新穎的環脂肽類抗生素，其中十個氨基酸構成環狀結構，在環外癸酸和色氨酸發生酯化。它不僅具有新穎的化學結構，且其作用模式也與任一已獲準抗生素不同。它能在多個方面破壞細菌細胞膜功能，由此迅速殺死革蘭陽性菌。達托霉素除能作用于大多數臨床相關革蘭陽性菌外，更重要的是在體外對已呈甲氧西林(methicillin)、萬古霉素和利奈唑胺等耐藥性分離菌株仍具強力活性。·達托霉素為發酵產物，通過發酵培養得到的發酵濾液，發酵過程中會產生大量的色素及與達托霉素結構相近似的副產物如脫水達托霉素，因此達托霉素的提取純化方法較復雜。一般達托霉素產生菌，生產能力不穩定，產量較低，發酵副產物較多，雜質較多，導致后提取工作較為復雜，大大地增加了后序的提純難度，難以獲得高純度的最終產物，從而無法產業化生產。對達托霉素后序的提取純化方法已經有不少文獻報導，比如安徽豐原發酵技術工程研究有限公司申請的《一種高純達托霉素的制備方法》(申請號200910085837. X)，它公開的大致工藝為發酵液經超濾、納濾、陽離子樹脂吸附酸洗、陰離子樹脂中和，納濾濃縮、結晶。膜過濾收率達到98 — 99%，產品經結晶后純度也能得到98. 5%以上。但達托霉素是個兩性物質，等電點約是PH4-5，在不同的pH條件下，它的溶解性是不同的，尤其是達托霉素存在有大量的同系物、異構體，這些雜質在性質上與達托霉素很相似，因此，通過這么簡單的工藝，在產業上要分離純化甚至結晶達托霉素是很困難的。成都雅途生物技術有限公司申請的專利《一種高純度達托霉素的純化制備方法》(申請號200910058577. 7)，該專利技術公開了運用一種反相硅膠材料把粗品精制成高純度的達托霉素。該方法僅是達托霉素粗品的精制，而沒有公開如何從發酵液制得成品。而達托霉素的原研公司美國卡比斯特制藥公司申請的專利《高純度脂肽、脂肽膠束及其制備方法》(申請號01805212. 6及其分案200810087401. X)公開了利用陰離子樹脂除去脫水達托霉素和β_異構，運用改良緩沖液-尿素洗脫樹脂，大致工藝發酵液經丁醇萃取，用陰離子樹脂吸附解吸，疏水相互作用色譜層析，再用陰離子交換色譜法進行反復層析得到高純度的達托霉素。整個制備過程涉及的方法較多萃取、離子交換、色譜層析、納濾、超濾等，尤其是萃取涉及的溶媒量較多，對生產保護和人身安全均不利。卡比斯特制藥公司另一專利《制備純化脂肽的方法》(申請號01821937. 3)，公開了運用結晶的方法來純化達托霉素，但得到是達托霉素含有鈣離子，并非用于制備注射用達托霉素的原料，且其所公開的試驗內容均為毫克級，與產業化距離很大，無法直接放大工業生產。文獻資料《達托霉素發酵液大孔樹脂吸附分離的研究》(中國抗生素雜志2008年2月第33卷第2期)介紹了達托霉素發酵液運用大孔樹脂富集的方法。這三份文獻公開的達托霉素的提取純化方法都存在操作步驟復雜，發酵液色素和雜質難去除，最終產品色澤深和純度不高等問題；而且，不同菌種發酵產生的不同發酵液不一定能用相同的提取方法。因此尋找更有效的脫色方法和更簡便的提取純化方法，才有可能實現達托霉素的工業化生產。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術中存在的達托霉素的提取純化工藝復雜，提純工藝難以產業化的缺陷，提供有效方法去除達托霉素中的色素，提高達托霉素的含量，并可適用 于工業化大生產的方法。本專利技術提供了，主要包括富集發酵液中的達托霉素、富集得到的達托霉素粗提取、達托霉素的精制、凍干幾個步驟。其中，粗提取先采用酸性柱層析，再用中性柱層析，這樣的工藝操作可以去除發酵液中存在的大部分的色素，降低部分雜質，如HPLC圖譜中主峰之后(RRT > I)和主峰之前(RRT < I)的雜質。其中所述的酸性柱，是指將欲層析的溶液和洗脫劑調至酸性，優選為中等酸性，如PH為2至4左右；該步有效的降低雜質，提高達托霉素的含量。中性柱層析是指將欲層析的溶液調至中性，如pH為6至8左右，洗脫劑pH自然，該步層析對RRT > I的后雜質降低有效。在精制時，采用中性層析和酸性層析來提純達托霉素，但該階段的層析主要是降低或減少粗提取過程中無法降低或去除的雜質。其中中性柱層析的主要目的是達到去除達托霉素HPLC圖譜中主峰之后的如脫水達托霉素等雜質(RRT > 1)，酸性柱層析以去除達托霉素HPLC圖譜中主峰之前的雜質(RRT < 1)，其中所述的中性柱是指將欲層析的溶液調至中性，如pH為6至8左右；該步層析可以進一步的減少色素，降低雜質脫水達托霉素的含量；酸性柱層析是指將欲層析的溶液和洗脫劑調至酸性，優選為中等酸性，如PH為2至4左右。為了達到更好的提取純化效果，本專利技術的提取純化方法優選 1)、發酵液中達托霉素的富集 A、在含有達托霉素的發酵液中投入大孔吸附樹脂，吸附后收集樹脂，裝入解吸柱中； B、用含低分子醇濃度低于50%且含有1-5%鹽的水溶液pH6-7進行解吸； C、用含低分子醇濃度高于50%的水溶液進行解吸，收集解吸液； D、解吸液納濾濃縮； 2)、粗提取 A、酸性柱層析調濃縮液pH至中等酸性(pH2-4);上柱后用40-55%的低分子醇濃度水溶液(PH2-4)階梯梯度洗脫；納濾濃縮； B、中性柱層析調濃縮液pH至中性，向濃縮液中加入1-5%鹽；上柱后用含30-45%低分子醇且含1-5%鹽的水溶液洗脫，洗脫量為樹脂柱體積的3 4倍；用20-30%低分子醇水溶液洗脫，收集洗脫流分；調PH至中性；納濾濃縮；3)、精制 A、中性柱層析濃縮液中加入f5%鹽，調整濃縮液pH中性；上柱后用5%低分子醇水溶液洗脫層析柱，洗脫量為柱體積的6-9倍；用10-20%低分子醇水溶液洗脫，洗脫量為柱體積的8-13倍，收集洗脫流分；調pH至中性；用HPLC法檢測所收集的流分，合并達托霉素歸一化含量大于等于92%的流分，納濾濃縮； B、酸性柱層析調濃縮液pH至中等酸性；上柱后，采用低分子醇和揮發性酸水溶液組成的混合洗脫劑進行線性梯度洗脫，洗脫量3飛倍柱體積時開始收集，在洗脫量達到8 14倍柱體積時停止洗脫；合并達托霉素歸一化含量大于等于95%的流分； 4)、凍干 冷凍干燥至粉末后，在20°C 30°C，壓力低于IOPa的條件下干燥2飛小時，得成品。其中，“含低分子醇濃度低于50%且含有1-5%鹽的水溶液”，是指水溶液中低分子醇濃度低于50%，并且中還含有1-5%鹽。在本申請文件中所提及的類似的水溶液中醇和/或鹽的濃度，均依以上解釋。其中所述的步驟I)中的大孔吸附樹脂為HZ818、X_5、HZ804、HZ816中的任一種；步驟2)的中的層析柱填料為PRP 512X18X8中的任一種，步驟3)層析柱的填料選用C18或C8。其中步驟I)中的解吸劑為為甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任一種，優選乙醇。其中所述的鹽為氯化鈉、乙酸銨中的任一種。其中所述的步驟2) A中的洗脫為先以40%左右的低濃度乙醇水溶液洗脫，用量為柱體積的2 4倍；再換成45%左右的乙醇水溶液洗脫，本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種達托霉素的提取純化方法，先將發酵液中達托霉素富集，再將富集得到的達托霉素粗提取、精制，最后凍干獲得；其中粗提取先采用酸性柱層析，再用中性柱層析；在精制時，先用中性柱層析，再用酸性柱層析。2.如權利要求I所述的提取純化方法，其特征是所述的 1)、富集 A、在含有達托霉素的發酵液中投入大孔吸附樹脂，吸附后收集樹脂，裝入解吸柱中； B、用含低分子醇濃度低于50%且含有1-5%鹽的水溶液pH6-7進行解吸； C、用含低分子醇濃度高于50%的水溶液洗脫解吸柱，收集解吸液； D、解吸液納濾濃縮； 2)、粗提取 A、酸性柱層析調濃縮液pH至中等酸性；上柱后用40-55%的低分子醇濃度水溶液階梯梯度洗脫；納濾濃縮； B、中性柱層析調濃縮液pH至中性，向濃縮液中加入1-5%鹽；上柱后用含30-45%低分子醇且含1-5%鹽的水溶液洗脫，洗脫量為樹脂柱體積的3 4倍；用20-30%低分子醇水溶液洗脫，收集洗脫流分；調PH至中性；納濾機濃縮； 3)、精制 A、中性柱層析濃縮液中加入f5%鹽，調整濃縮液pH中性；上柱后用5%低分子醇水溶液洗脫層析柱，洗脫量為柱體積的6-9倍；用10-20%低分子醇水溶液洗脫，洗脫量為柱體積的8-13倍，收集洗脫流分；收集的流分調pH至中性；用HPLC法檢測所收集的流分，合并達托霉素歸一化含量大于等于92%的流分，納濾機濃縮； B、酸性柱層析調濃縮pH至中等酸性；上柱后，采用低分子醇和揮發性酸水溶液組成的混合洗脫劑進行線性梯度洗脫，洗脫量3飛倍柱體...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳曉霞，張宇鍇，章杰，朱健，謝祥茂，顏林華，高興蓉，
申請(專利權)人：杭州華東醫藥集團生物工程研究所有限公司，
類型：發明
國別省市：