肝靶向穿膜抗病毒融合多肽及其編碼基因與應用制造技術

本發明專利技術公開了一種肝靶向穿膜抗病毒融合多肽及其編碼基因與應用，該融合肽是由SEQIDNO:1的氨基酸殘基序列組成的多肽。本發明專利技術還公開了所述肝靶向穿膜肽-天蠶素融合肽的編碼基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:2。本發明專利技術融合多肽具有以下優點：1)定位準確、高效結合；2)競爭性阻斷和胞內靶向殺傷；3)毒副作用小。本發明專利技術在醫學和生物制藥領域，尤其是抗HBV藥物的制備領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體涉及ー種具有肝靶向穿膜作用的抗病毒融合肽及其編碼基因與應用。
技術介紹
こ型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)為嗜肝病毒,全世界超過3· 5億人感染HBV，我國是HBV高流行區，根據全國人群こ肝血清流行病學調查，人群HBsAg攜帯率達7.18%，約9300萬人。HBV感染會導致急慢性こ型肝炎的發生，是引起肝硬化、肝細胞癌的重要因素之一，毎年死于こ肝相關性疾病高達100萬人，WHO已將該病毒感染列為全球十大最常見致死病因之一。大量的臨床研究證明，HBV在體內持續存在和不斷復制引起肝臟病變的持續活動和發展是導致病情進展的根本原因，因此尋求有效的治療藥物及給藥途徑最大限度地長期抑制或清除HBV顯得尤為重要。盡管目前有核苷類藥物和干擾素等抗HBV制 齊U，但由于HBV主要在肝細胞內寄生和復制，単獨使用這類抗病毒藥物時，在體內容易擴散降解，導致相對平均的組織分布，未能在肝細胞內形成有效的抗病毒作用濃度，因而存在著給藥劑量大，用藥次數多、副作用大及產生耐藥性等問題，故HBV感染的治療仍然是目前面臨的一道難題。近年，肝靶向藥物制劑的研究為抗HBV藥物劑量及副作用的限制問題提供了可期待的解決途徑?？共《舅幬锏母伟邢蛑苿┚哂刑禺愋院?、選擇性強、能減少藥物用量和給藥次數，以及降低毒副作用和提高藥物療效等優點。然而，由于受體水平和載體的種類、大小及特異性等多種因素的影響，目前的靶向研究雖具有一定的靶向性，尚存在難以達到細胞水平的精確靶向、易被機體免疫系統清除等不足。肝祀向穿膜妝(hepatocyte-targetingand penetrating peptide,HTPP)位于惡性痕原蟲環子孢子蛋白(circumsporozoite protein, CSP)保守I區上游。CSP在痕原蟲子孢子特異性粘附、入侵肝細胞中起著重要作用。通過靜脈注射，重組的CSP在幾分鐘內就能結合并進入肝細胞，表明CSP有高效而特異的肝細胞靶向性。研究發現其中HTPP肽段與人肝癌細胞HepG 2具有高親和カ(80nM)，可特異性結合肝細胞表面的受體硫酸こ酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfateproteoglycans, HSPG)。HSPG是由核蛋白分子和糖胺聚糖(gly-cosaminoglycan, GAG)通過糖苷鍵共價結合組成的復合大分子。研究顯示肝臟的HSPG具有獨特的GAG鏈，其硫酸化程度顯著高于其它組織，尤其是GAG鏈的N和O位的硫酸化決定了 CSP等對肝臟的特異選擇性。同時近年研究表明肝細胞表面的HSPG是HBV的初始黏附受體，在HBV感染第一步的細胞黏附中起著關鍵性作用。因此，以HSPG為新靶點阻斷HBV粘附有助于發展新型藥物拮抗病毒。近年研究顯示在HTPP中還含有ー個PELEX/VTS基序，能夠有效穿透肝細胞膜，介導CSP進入肝細胞內部，實現細胞亞定位?；谏鲜霭l現，故HTPP成為備受青睞的靶向穿膜部位?？咕?antimicrobial peptides, AMP)是生物免疫系統產生的ー類抵抗外界病原體感染的小分子多肽，具有廣譜抗菌活性、抗病毒活性和腫瘤細胞殺傷毒性，在低濃度條件下還有免疫調節作用，但對高等動物機體的正常細胞無損傷，且極少產生耐藥性。近年，AMP的抗病毒研究逐漸成為熱點，其抗病毒機制涉及通過結合細胞表面HSPG，阻斷病毒粘附侵入；抑制病毒DNA復制，以及刺激機體免疫反應等。早在1993年我國研究人員以抗菌肽柞蠶素對鴨こ型肝炎病毒感染后的治療作用表明，給藥10天后可顯著降低血清中鴨肝炎病毒的DNA水平。大連生物技術研究所發現柞蠶素對こ型肝炎病毒DNA復制有明顯抑制作用，100例こ型肝炎臨床試驗結果良好臨床治愈率60%，HBeAg轉陰率達62%，未發現任何毒副作用。大連水產制藥廠腎肝寧(含柞蠶素)治療肝炎臨床試驗154例，治愈率29. 2%，有效率83. 2%，獲得了廣東省衛生廳新藥證書粵衛藥準字(1996)第107388號。這些研究表明抗菌肽對HBV病毒的抑制作用是確定的。家蠅有獨特的免疫防御機制，從幼蟲到成蟲均生活在雜菌橫生的環境，比一般生物能更有效抵御病原生物的感染。家蠅天蠶素(ifescadomestica cecropin, MDC)是本實驗室從家蜆中克隆的ー種昆蟲抗菌肽(Genbank登錄號為EF175878)，研究顯示家蠅天蠶素具有顯著的殺菌作用，并對人肝癌細胞具有明顯抑制作用，但對人正常肝細胞和紅細胞無毒性。另ー方面，家蠅天蠶素治療組裸鼠脾臟的生發中心面積增大，提示家蠅天蠶素可能對裸鼠的免疫功能有較好的促進作用。更有意義的是將家蠅天蠶素體外作用于H印G 2. 2. 15細胞，發現其對H印G 2. 2. 15細胞的HBsAg表達具有抑制作用，并呈現一定的濃度依賴關系。因此，家蠅天蠶素成為非常理想的抗病毒作用部位。
技術實現思路
本專利技術的目的在于根據現有抗こ肝病毒藥物中存在的上述不足，提供ー種新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽，及其編碼基因與應用。本專利技術通過SOE-PCR方法構建新型融合基因，通過人工合成方法和重組原核表達載體重組表達方法，分別獲得了該融合基因所編碼的多肽片段，并經實驗證明該融合多肽具有靶向穿膜作用和抗病毒作用，為ー種新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽。本專利技術的新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽，其特征在于，它含有SEQ ID N0:1的氨基酸序列。編碼上述肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。本專利技術還提供一種重組表達載體，它含有編碼上述肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的基因。該重組表達載體可以是在原核表達載體pET32a的多克隆位點插入上述編碼上述肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的基因而構建的重組表達質粒。本專利技術還提供一種重組工程菌，它含有上述的重組表達載體。這可以是將上述的重組表達載體轉化大腸桿菌(例如^: COli BL21而得到的)。本專利技術經實驗證明，上述的新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽，具有靶向穿膜作用和抗病毒作用。因此，該融合多肽可用于制備抗こ型肝炎病毒藥物。本專利技術的新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽可通過以下方法之ー制備 I、根據所述融合多肽的氨基酸序列，用固相合成法合成多肽。2、將編碼所述融合多肽的核苷酸序列克隆入表達載體，并將重組后的質粒轉化宿主細胞，進行重組表達。純化后獲得該融合多肽。作為ー種優選方案，上述制備方法2中所述構建重組表達載體時所用的表達載體優選但不限于原核表達載體pET32a。作為ー種優選方案，上述制備方法2中所述表達宿主菌優選但不限于大腸桿菌。與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果 本專利技術將具有肝靶向和肝細胞膜穿透作用的短肽與具有抗病毒作用但不損害正常真核細胞功能的家蠅天蠶素融合，構建的融合多肽與目前研究比較，具有能達到細胞水平的精確主動靶向和不易被機體免疫系統清除等特點，有望成為定位準確、高效結合、競爭性阻斷和靶向殺傷的新型生物導彈藥物，因而具有非常好的應用前景，將給社會帶來一定的經濟效益和社會效益。附圖說明圖I為融合基因重組示意 圖2為SOE-PCR重組融合基因。其中，M為DNA分子量標準(20bp) ；1~2為第一輪PCR擴增產物；3為重組的全長融合基因； 圖3為重本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種肝靶向穿膜抗病毒融合多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。2.編碼權利要求I所述肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.—種重組表達載體，其特征在于是在原核表達載體pET...

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱家勇，盧雪梅，金小寶，黃演婷，汪潔，
申請(專利權)人：廣東藥學院，
類型：發明
國別省市：