一種硫酸軟骨素二糖、四糖、六糖的制備方法，屬于食品技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)以硫酸軟骨素為原料，采用透明質(zhì)酸酶降解制備得到硫酸軟骨素寡糖，經(jīng)G-25凝膠過濾分離、G-10脫鹽、DEAE纖維素52陰離子交換色譜柱分離、天然制備凝膠電泳分離等，制備得到硫酸軟骨素二糖、四糖及六糖。本發(fā)明專利技術(shù)涉及的一種硫酸軟骨素二糖、四糖、六糖的制備方法，首次實現(xiàn)了三種硫酸軟骨素寡糖的同時制備，為單一聚合度硫酸軟骨素寡糖的工業(yè)制備提供了技術(shù)依據(jù)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
ー種硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的制備方法，屬于食品エ業(yè)
技術(shù)介紹
硫酸軟骨素(CS)，作為糖胺聚糖的ー種，是三種最重要的糖胺聚糖之一。它由D-葡糖醛酸與N-こ酰-D-氨基半乳糖酸硫酸酯組成，是廣泛存在于人類和動物的喉骨、鼻中隔、氣管等軟骨組織中的ー類酸性黏多糖。高分子質(zhì)量的CS表現(xiàn)出高的生物活性，如抗癌癥、抗動脈粥樣硬化作用、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等，不僅在細胞轉(zhuǎn)移、分化、増殖、識別以及組織形成等生物過程中起到了重要的作用，并已用于醫(yī)藥及臨床的應(yīng)用。但由于高分子量，高表觀粘度、低水溶性及復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，大部分高分子多糖很難通過組織屏障與細胞內(nèi)部的受體結(jié)合。且由于細胞膜的選擇透過性等因素，臨床應(yīng)用中大部分糖胺聚糖面臨生物利用率較低的主要問題。最近幾年，低分子質(zhì)量CS的功能特性越來越受到人們的重視。與其它糖胺聚糖，如透明質(zhì)酸，硫酸類肝素相比，低分子量CS的研究相對落后。目前國內(nèi)對CS的研究主要集中于CS的提取、生理活性及衍生物等方面，對CS寡糖的研究未見報道，國際上對CS寡糖的分離提純報道也不多，単一寡糖的研究較少。本專利技術(shù)涉及的ー種硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的制備方法，以硫酸軟骨素為原料，采用透明質(zhì)酸酶降解制備得到硫酸軟骨素寡糖，經(jīng)G-25凝膠過濾分離、G-IO脫鹽、DEAE纖維素52陰離子交換色譜柱分離、天然制備凝膠電泳分離等，制備得到硫酸軟骨素ニ糖、四糖及六糖，首次實現(xiàn)了三種硫酸軟骨素寡糖的同時制備，為單一聚合度硫酸軟骨素寡糖的エ業(yè)制備提供了技術(shù)依據(jù)；為糖類化合物的糖庫的建立及糖類藥物的篩選提供重要的分離手段；可為臨床藥物的生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供ー種硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的制備方法。本專利技術(shù)的技術(shù)方案ー種硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的制備方法，以硫酸軟骨素為原料，采用透明質(zhì)酸酶降解制備得到硫酸軟骨素寡糖，經(jīng)G-25凝膠過濾分離、G-IO脫鹽、DEAE纖維素52陰離子交換色譜柱分離、天然制備凝膠電泳分離等，制備得到硫酸軟骨素ニ糖、四糖及六糖。步驟為 (1)硫酸軟骨素的酶法降解 將O. 2 g硫酸軟骨素溶解于10 mL pH 5. 9的磷酸鹽緩沖液中，置于37°C保溫10 min,使其與反應(yīng)溫度達到一致，后向底物溶液中加入透明質(zhì)酸酶HAase，使其酶活為I. 4X IO5u/L，以150轉(zhuǎn)/分鐘的振蕩速度振蕩反應(yīng)22h-24h ;反應(yīng)結(jié)束后，加熱煮沸20min使酶失活，4000r/min離心15min，取上清液加3倍體積95%こ醇沉淀，靜置，用IOmL無水こ醇脫水3次，真空干燥得硫酸軟骨素寡糖； (2)硫酸軟骨素寡糖的凝膠過濾分離 將處理好的Sephadex G_25裝成I. 6 X 150 cm的玻璃層析柱,用去離子水將硫酸軟骨素寡糖配制成40 mg/mL的溶液,上樣量I mL,用5倍柱體積的超純水以4 mL/min流速洗脫，用分布收集器Redfrac95定時自動收集，4mL/管，用咔唑反應(yīng)檢測糖醛酸含量以確定糖的出峰位置； (3)G-10脫鹽收集到的樣品40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后經(jīng)S印hadexG-10,1.6X150 cm，脫鹽分離以后，濃縮樣品到約50mL，再凍干，以捕獲自由基能力為檢測指標，篩選出抗氧化活性最高的硫酸軟骨素寡糖，作為下一歩分離對象； (4)硫酸軟骨素寡糖的陰離子交換分離 裝柱將浸泡好的DEAE纖維素52，沿玻璃棒緩慢加入到層析柱中2cmX20cm，避免膠中氣泡產(chǎn)生(如果產(chǎn)生氣泡，可用玻璃棒輕輕攪拌，使氣泡溢 出)，根據(jù)重力作用使凝膠慢慢沉降，并保持表面平整； 預(yù)平衡層析柱接好恒流泵后，用超純水平衡柱子，以2mL/min的速率洗脫3_5個柱體積至基線平穩(wěn)； 樣品處理將步驟(3)篩選出的硫酸軟骨素寡糖用超純水溶解至10 mL，上樣到DEAE纖維素52陰離子交換柱； 洗脫上樣lmL，用0-lmol/L NaCl梯度洗脫75min，洗脫速率為2mL/min，210nm紫外檢測；收集各洗脫峰； (4)硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的天然制備凝膠電泳分離 溶液配制 A液:硼酸O. lmol/L，Tris O. lmol/L，こニ胺四こニ酸O. 01 mol/L，加水溶解使ρΗ8· 3。質(zhì)量濃度5%的濃縮膠每100 mL濃縮膠含丙烯酰胺4. 75 g、甲叉雙丙烯酰胺O. 25g，并用鹽酸調(diào)PH 6. 3 ;每3mL濃縮膠加入10%過硫酸銨水溶液100 μ L，TEMEDIO μし質(zhì)量濃度35%的分離膠每100 mL分離膠含丙烯酰胺31. 82 g、甲叉雙丙烯酰胺3.18 g和蔗糖15 g0每IOmL分離膠加入10%過硫酸銨水溶液200 μ L，TEMED 20 μし分離膠和濃縮膠均用A液配制。電極緩沖液甘氨酸I. 25 mol/L, Tris O. 2 mol/L，加水溶解使pH 8. 3。上樣將經(jīng)DEAE-52陰離子交換色譜分離的洗脫峰上樣。電泳條件室溫，400V，4_5h。染色0. 5%甲苯胺藍溶于2%こ酸溶液中，染色lOmin。脫色2%こ酸脫色。樣品收集樣品脫色后，分別將電泳條帶中含量最多組分剪下，搗碎，置于ImL PBS溶液中震蕩。12h后離心，取上清液，置于4°C保存。沉淀繼續(xù)置于ImL PBS溶液中震蕩。重復(fù)三次后，將三次所得上清液過AKTA superdex P印tide柱脫鹽，冷凍干燥即得硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖。本專利技術(shù)的有益效果本專利技術(shù)方法首次實現(xiàn)了硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖三種硫酸軟骨素寡糖的制備，首次實現(xiàn)了三種硫酸軟骨素寡糖的同時制備，為單一聚合度硫酸軟骨素寡糖的エ業(yè)制備提供了技術(shù)依據(jù)。附圖說明圖I :硫酸軟骨素寡糖的DEAE纖維素52層析圖。圖2 :硫酸軟骨素寡糖的制備PAGE電泳圖。A為圖I中A峰的PAGE電泳圖，B為圖I中B峰的PAGE電泳圖，C為圖I中C峰的PAGE電泳圖；圖中畫圈部分為提供下ー步經(jīng)凝膠過濾色譜柱進行分子量鑒定的組分a、b、C。圖3:硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖分子量測定圖。a為圖2中組分a (硫酸軟骨素ニ糖)分子量測定圖、b為圖2中組分b (硫酸軟骨素四糖)分子量測定圖、c為圖2中組分c (硫酸軟骨素六糖)分子量測定圖。具體實施例方式實施例I I、酶法降解制備硫酸軟骨素寡糖 將O. 2 g硫酸軟骨素溶解于10 mL pH 5. 9的磷酸鹽緩沖液中，置于37°C保溫10 min,使其與反應(yīng)溫度達到一致，后向底物溶液中加入透明質(zhì)酸酶(HAase，來自牛睪丸)，使其酶活為1.4X105 u/L，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)22h。反應(yīng)結(jié)束后，加熱煮沸20min使酶失活，4000r/min離心15min，取上清液加3倍體積95%こ醇沉淀，靜置，用IOmL無水こ醇脫水3次，真空干燥得硫酸軟骨素低聚糖A，并測定所得降解產(chǎn)物的總抗氧化活性(Τ0Α)。2、總抗氧化活性的測定 據(jù)總抗氧化能力(TOA)測定試劑盒說明書測定。測定原理機體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。在37°C時，毎分鐘每毫升溶液使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加O. 01，為ー個總抗氧化能力単位。3、硫酸軟骨素寡糖的凝膠過濾分離 將處理好的本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
【技術(shù)特征摘要】
1. 一種硫酸軟骨素二糖、四糖、六糖的制備方法，其特征在于，以硫酸軟骨素為原料，采用透明質(zhì)酸酶降解制備得到硫酸軟骨素寡糖，經(jīng)G-25凝膠過濾分離、G-IO脫鹽、DEAE纖維素52陰離子交換色譜柱分離、天然制備凝膠電泳分離，制備得到硫酸軟骨素二糖、四糖及六糖；具體步驟為 (1)硫酸軟骨素的酶法降解 將0.2 g硫酸軟骨素溶解于10 mL pH 5. 9的磷酸鹽緩沖液中，置于37°C保溫10 min,使其與反應(yīng)溫度達到一致，后向底物溶液中加入透明質(zhì)酸酶HAase，使其酶活為I. 4X IO5u/L，以150轉(zhuǎn)/分鐘的振蕩速度振蕩反應(yīng)22h-24h ;反應(yīng)結(jié)束后，加熱煮沸20min使酶失活，4000r/min離心15min，取上清液加3倍體積95%乙醇沉淀，靜置，用IOmL無水乙醇脫水3次，真空干燥得硫酸軟骨素寡糖； (2)硫酸軟骨素寡糖的凝膠過濾分離 將處理好的Sephadex G_25裝成I. 6 X 150 cm的玻璃層析柱,用去離子水將硫酸軟骨素寡糖配制成40 mg/mL的溶液,上樣量I mL,用5倍柱體積的超純水以4 mL/min流速洗脫，用分布收集器Redfrac 95定時自動收集，4mL/管，用咔唑反應(yīng)檢測糖醛酸含量以確定糖的出峰位置； (3)G-10脫鹽收集到的樣品40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后經(jīng)S印hadexG-10,1.6X150 cm，脫鹽分離以后，濃縮樣品到50mL，再凍干，以捕獲自由基能力為檢測指標，篩選出抗氧化活性最高的硫酸軟骨素寡糖，作為下一步分離對象； (4)硫酸軟骨素寡糖的陰離子交換分離 裝柱將浸泡好的DEAE纖維素52，沿玻璃棒緩慢加入到層析柱中2cmX20cm，避免膠中氣泡產(chǎn)生，如果產(chǎn)生氣泡，用玻璃棒輕輕攪拌，使氣泡溢出，根據(jù)重力作用使凝膠慢慢沉降，并保持表面平整； 預(yù)平衡層析...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：金征宇，王金鵬，張蓮，徐學(xué)明，謝正軍，趙建偉，周星，焦愛權(quán)，楊哪，陳曉明，田耀旗，
申請(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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