用于CD34-陰性干細胞的擴增培養基制造技術

本發明專利技術提供細胞生長培養基，其包含(a)無直徑大于0.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2％至15％；(b)無直徑大于0.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1％至10％；(c)濃度為所述細胞生長培養基的0U/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為0.5mM至10mM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75％至97％，并且可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細胞生長培養基允許人類CD34”干細胞的擴增，且其中得到的經擴增的CD34”干細胞保持分化的能力。本發明專利技術還提供了相關的細胞生長培養基補充物、無菌的人類血小板裂解物和人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物、試劑盒、含CD34’干細胞的組合物，以及相關的生產和細胞擴增方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于CD34-陰性干細胞的擴增培養基本申請要求2009年12月23日提交的申請號為61/289，796的美國臨時申請的優先權,其全部內容通過引用并入本文。本申請通篇引用了不同的出版物。這些出版物的公開內容在此通過引用并入本申請，以便更全面地描述本專利技術涉及的技術現狀。
技術介紹
來源于骨髓和臍血的人類非造血干細胞越來越多地被用作用于患者的再生和免疫調節指征的間充質細胞。在全球范圍內已經利用間充質干細胞實施了超過80例臨床試驗。幾乎所有的研究人員都使用含胎牛血清(FBS)的培養基作為標準血清補充物。FBS是牛源的，可以傳播TSE(即可傳播性海綿狀腦病)和刺激接受者的免疫應答。只有無BSE的牛被權威機構核準用于人類(新西蘭)，研究人員正努力研發用于促進細胞生長的替代方法。由于細胞療法很可能在未來幾年將被越來越多地使用，隨之而來的將是FBS的短缺。ー些公司已經研發了無血清培養基。但是這些培養基顯示出比理想的生長速率低的生長速率，骨髓源性CD34-陰性干細胞的形態和性質在這些培養基中不能如在含FBS培養基中那樣廣泛表征。人類凝血細胞(即血小板)已經被其他研究人員用作新鮮冰凍血漿(FFP)，用作促生長成分。血小板及其用于再生醫學的潛在意義由Stellos和Gawaz,以及Langer和Gawaz分別評述。關于使用血小板或FFP的干細胞擴增可提及本領域的下列具體教導。Schallmoser等人公開了使用血小板裂解物的間充質干細胞擴増。Capelli等人公開了未過濾的人類血小板裂解物用于擴增和生產間充質基質細胞的用途。Kocaoemer等人公開了人類AB血清和凝血酶激活的富血小板血漿在擴增來自脂肪組織的間充質干細胞中的用途。Muller等人公開了用于分離和擴增來自人類骨髄的多潛能間充質基質細胞的無動物血清培養條件，所述條件使用FFP和血小板兩者。Blande等人公開了脂肪組織間充質干細胞在無動物血清培養基中的擴增，所述無動物血清培養基中補充有已經無菌過濾的人自體血小板裂解物。而且，SalvadS等人公開了血小板裂解物在培養間充質基質細胞中的用途，其中所述裂解物是無菌過濾的。盡管血小板裂解物和FFP用于培養間充質干細胞的已知用途，仍然存在未滿足的需求，即更快速、更低廉和更安全地以穩定方式培養這種細胞，同時保留其以后在需要時進行分化的能力。
技術實現思路
本專利技術提供了一種細胞生長培養基，其包含(a)無直徑大于O. 22 μ m的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2%至15% ；(b)無直徑大于O. 22 μ m的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1%至10% ；(c)濃度為所述細胞生長培養基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75%至97%，且可以包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，所得經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力。本專利技術還提供了一種細胞生長培養基補充物，其包含 (a)無直徑大于O. 22 μ m的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的17%至94% ;和(b)無直徑大于O. 22 μ m的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的6%至83% ；其中在將所述細胞生長培養基補充物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力，所述細胞生長培養基包含(i)3體積％至25體積％的細胞生長培養基補充物；(ii)濃度為OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)濃度為O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。本專利技術另外提供了ー種無直徑大于O. 22 μ m的固體物質的人類血小板裂解物，其中根據下列步驟制備所述血小板裂解物(i)冷凍血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再次離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的過濾器實施最后一次過濾。本專利技術還另外提供了ー種無直徑大于O. 22 μ m的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中根據下列步驟制備所述FFP濾出物⑴融化FFP ；(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP ;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的過濾器實施最后ー次過濾。本專利技術還提供了ー種用于擴增人類⑶34_干細胞的試劑盒，其在分開的區室中包含(a)無直徑大于O. 22 μ m的固體物質的人類血小板裂解物，和(b)無直徑大于O. 22 μ m的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中⑴所述裂解物構成(a)和(b)合并的體積的17%至94%; (ii)所述FFP濾出物構成(a)和(b)合并的體積的6%至83%，和(iii)在將所述裂解物和所述濾出物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得經擴增的CD34—干細胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內容物構成所述培養基體積的3%M 25% ;和(ii)肝素的濃度為OU/ml至I OU/ml 0本方明還提供了ー種物質組合物，其包含(a)人類⑶34_干細胞和(b)上述任意 實施方式的主題細胞生長培養基。本專利技術另外提供了一種用于制備無直徑大于O. 22 μ m的固體物質的人類血小板裂解物的方法，其包括下列步驟(i)冷凍血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的過濾器實施最后一次過濾。本專利技術還另外提供了一種用于制備無直徑大于0.22 μ m的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物的方法，其包括下列步驟⑴融化FFP ；(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP ;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2009.12.23 US 61/289,7961.細胞生長培養基，其包含 (a)無直徑大于O.22 μ m的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2%至15% ； (b)無直徑大于O.22 μ m的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1%至10% ； (c)濃度為所述細胞生長培養基的OU/ml至10U/ml的肝素； (d)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和 (e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75%至97%，且所述無血清低葡萄糖培養基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺； 其中所述細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，所得經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力。2.如權利要求I所述的細胞生長培養基，其中根據下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物 (i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解； ( )融化所得經裂解的血小板； (iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板； (iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和 (v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的過濾器實施最后ー次過濾。3.如權利要求2所述的細胞生長培養基，其中如下制備步驟(i)的人類血小板濃縮物離心血小板并由此使其成丸；分離成丸的血小板和液相；并在FFP中重懸得到的血小板。4.如權利要求I 3之一所述的細胞生長培養基，其中如下制備部分(b)的FFP濾出液融化人類FFP ;以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心所得融化的FFP ;和使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的過濾器實施最后一次過濾。5.如權利要求I 3之一所述的細胞生長培養基，其中如下制備部分(b)的FFP濾出液⑴融化人類FFP ； (ii)冷凍融化的人類FFP ; (iii)融化所得的人類FFP ;和(iv)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心所得融化的FFP。6.如權利要求5所述的細胞生長培養基，其中在離心步驟(iv)之前至少再一次冷凍和融化來自步驟(iii)的融化的FFP。7.如權利要求5或6之一所述的細胞生長培養基，其中省略對得自步驟(iv)的液體部分的過濾。8.如權利要求I 7之一所述的細胞生長培養基，其中所述細胞生長培養基不含動物血清。9.如權利要求I 8之一所述的細胞生長培養基，其中所述血小板裂解物和FFP濾出物與血型抗原ABO和Rh相匹配。10.細胞生長培養基補充物，其包含 (a)無直徑大于O.22 μ m的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的17%至94% ;和 (b)無直 徑大于O.22 μ m的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的6%至83% ; 其中在將所述細胞生長培養基補充物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力，所述細胞生長培養基包含(i)3體積％至25體積％的細胞生長培養基補充物；(ii)濃度為OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)濃度為O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。11.如權利要求10所述的細胞生長培養基補充物，其還包含肝素，其中在將所述細胞生長培養基補充物與含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力，所述細胞生長培養基包含3體積％至25體積％的細胞生長培養基補充物，并且含有OU/ml至10U/ml的肝素。12.如權利要求10和11之一所述的細胞生長培養基補充物，其中根據下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物 (i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解； ( )融化所得經裂解的血小板； (iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板； (iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和 (v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的過濾器實施最后ー次過濾。13.如權利要求10 12之一所述的細胞生長培養基補充物，其中根據下列步驟制備部分(b)的FFP濾出物 ⑴融化人類FFP ； ( )以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP ;和 (iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的過濾器實施最后一次過濾。14.如權利要求10 13之一所述的細胞生長培養基補充物，其中所述細胞生長培養基補充物不含動物血清。15.如權利要求10 14之一所述的細胞生長培...

【專利技術屬性】
技術研發人員：埃琳娜·阿塞瓦，克里斯廷·岡瑟，
申請(專利權)人：埃普塞斯有限責任兩合公司，
類型：發明
國別省市：