本發明專利技術涉及旱稻孢囊線蟲特異性RAPD和SCAR標記快速分子檢測方法，屬生物技術領域。旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記的DNA片段，具其如SEQ?ID?NO1所示的核苷酸序列。根據旱稻孢囊線蟲特異性RAPD擴增片段，設計特異性引物HeF1和HeR1，將其轉化為更加穩定的SCAR標記片段，在SCAR標記快速分子檢測旱稻孢囊線蟲的方法中，可擴增出434bp的特異性片段。本發明專利技術提高了分子檢測靈敏度并且快速準確，在旱稻孢囊線蟲檢測以及旱稻孢囊線蟲病的早期診斷方面，具有很高的應用價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬生物
，涉及旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記全序列、特異性SCAR標記引物序列及旱稻孢囊線蟲SCAR標記快速分子檢測方法。
技術介紹
旱稻抱囊線蟲(Heteroderaelachista Ohshima, 1974),最早發現于日本的櫪木縣山地稻田中(Ohshima, 1974)，廣泛分布于日本的東北地區和九州地區，主要侵染水稻，目前在伊朗和中國也有分布。該病害引起的產量損失范圍在 7%-19%(Bridgeet ,Nematode parasites ofrice, Plant parasitic nematodes m tropical andsubtropical agriculture. Wallingford, UKj CABI Publishing, 1990，69-108)。ニ齡幼蟲在五月中旬侵染旱稻根部，卵在五周后開始沉積，孢囊在6-8周后開始形成(ShimizuK. seasonal iluctuation and rhizospherical distribution of population oi theupland rice cyst nematode, Heterodera elachista. Japanese Journal of Nematology1977，7:49-57)。丁中(賀沛成，洪宏，伍敏敏，丁中·旱稻孢囊線蟲(Heteroderaelachista)孵化特性研究.植物保護，2011，37 (6) : 101-103)研究發現，旱稻孢囊線蟲適宜的孵化溫度是28-32°C，與玉米孢囊線蟲類似，最佳孵化溫度均為30°C左右(Hashmib, Krusoerg LR. Factors miluencmg emergence of juveniles from cysts oiHeterodera zera. Journal of Nematology. 1995, 27 (3) : 362-369)。在我國，目前旱稻抱囊線蟲僅在湖南湖北部分地區有報道。旱稻孢囊線蟲屬于Cyperi群組，在形態上與H. oryzae, H. sacchari和H.Ieuceilyma非常相近。其與H. sacchari和H. Ieuceilyma最明顯的區別是在孢囊細長的下橋上缺乏指形的投影，而與H. oryzae相比，孢囊略小，ニ齡幼蟲長度略短。目前旱稻孢囊線蟲的鑒定大部分仍然依賴于傳統的形態學鑒定方法，但是由于形態學鑒定耗時、需要很熟練的技術作為基礎，并且需要專門從事分類的人員來完成，這些原因使傳統的鑒定方法時常存在一定誤差并且不適用于大規模的樣品檢測。為了彌補形態學鑒定的不足，快速、準確的對農作物孢囊線蟲進行鑒定和檢測，分子檢測技術迅速發展。20世紀80年代后期發展成功的DNA多聚酶鏈式反應(PCR)，使得直接擴增DNA成為可能，在此基礎上還產生了各種新的分子標記技術，這些分子標記和檢測技術都成功的應用到植物寄生線蟲特別是農作物孢囊線蟲的分類鑒定和檢測過程中。特異性引物PCR或多重PCR技術是近年來線蟲分子診斷取得的重要進展。通過一次PCR測驗就可以在混合樣品中特異性地檢測出ー個或多個線蟲種。例如Subbotin SA, Peng D L 等(Subboton S A, Peng D L, Moens M. A rapid method for theidentmcation of the soybean cyst nematoae Heterodera glycines using duplexPCR. Nematology 2001, vol. 3 (4) :365-371)運用雙重PCR檢測大豆孢囊線蟲的方法，在一個PCR反應體系中同時運用通用引物D3A和D3B以及特異性引物GlyFl和rDNA2，從52個大豆孢囊線蟲群體中均擴增出兩個DNA片斷(181bp and345bp),檢測的敏感度高達單個孢囊、單頭ニ齡幼蟲的微量DNA。此外，PCR技術對其他植物寄生線蟲種類的檢測也有較多進展。近年來，基于PCR技術的各種分子標記迅速發展起來，各種分子標記檢測技術特異性更高，檢測更準確，在植物寄生線蟲的分子檢測中應用也越來越廣泛。1990年，Williams 等和 Welsh 等(Welsh Jj MeClelland M. Fingerprinting genomes using PCRwith arbitrary primers. Nuc IicAcids Research·，1990，18:7213-7218)兩個研究小組幾乎同時發現了一種新的分子標記一RAPD標記(Random Amplified Polymorphism DNA)。RAPD引物為隨機的寡聚核苷酸，長度多為10個核苷酸左右，通過PCR反應擴增基因組DNA，從而產生不連續的DNA產物，結合瓊脂糖凝膠電泳也可以獲得不同的圖譜。由于不同基因組DNA序列堿基位點具有明顯的差異，在不同區段上可與引物發生結合的位點也不盡相同，因此擴增條帶的大小數量等特征也不同，從而使不同的種表現出多態性。RAH)優點是所需DNA量極少，要求設備也相對簡單，但是由于RAPD引物非常短，只有十個堿基，退火溫度也較低，如果PCR體系變化，或者儀器變化，重復性會變差，而且易產生非特異性的條帶。為了彌補這ー不足，可以將其轉為SCAR (sequence characterized amplifiedregion)標記。RAPD轉化的SCAR標記技術由Paran和Michelmore于1993年提出并應用(Paran I，Michelmore R W. Development ofreliabie PCR-based markers linkedto downy mildew risistence genes in lettuce, meoretical and Applied genetics1993,85:985-993.)。Edward P. Caswe 11 -Chen 等(Edward P，Caswell-Chenj ValerieMj Williamson, FrancesF. Wu. Random amplified polymorphic DNA analysis ofHeterodera cruciferae and H. schachtiI populations. Journal of Nematology1992，24(3) :343-351)運用 RAH)標記區分了 H. cruciferae 和 H. schachtii，用 10 個不同的隨機引物擴增燕麥孢囊線蟲的不同種群的DNA，產生了 78條清晰的譜帶。1995年Lopez-Braiia I 等對禾谷孢囊線蟲群體做了 RAPD 分析。Jianbo Li (Jianbo Li，JamalFaghhihij John M. Ferris, et al. The use of RAPD amplified DNA as markers forvirulence characteristics in soybean syst menat本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記的DNA片段，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。2.根據權利要求I所述的旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記的DNA片段的保守序列設計的特異性引物。3.根據權利要求2所述的特異性引物為HeFl和HeRl，其序列為HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3’，HeRl :5’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3> 4.旱稻孢囊線蟲SCAR標記快速分子檢測方法，其特征在于PCR反應體系中含有權利要求I或2所述的特異性引物。5.根據權利要求4所述的檢測方法，所述PCR反應體系中含有特異性引物HeFl和HeRl,其序列為HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3’，HeRl :5’ -GA...
【專利技術屬性】
技術研發人員：彭德良，亓曉莉，彭煥，黃文坤，丁中，賀文婷，
申請(專利權)人：中國農業科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：
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