本發(fā)明專利技術(shù)為“豌豆孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記和SCAR標(biāo)記快速分子檢測方法”，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。豌豆孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段，其具有如SEQ?ID?NO1所示的核苷酸序列。根據(jù)該豌豆孢囊線蟲特異性RAPD擴(kuò)增片段，設(shè)計特異性引物HgoF1和HgoR1，將其轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記片段，在SCAR標(biāo)記快速分子檢測豌豆孢囊線蟲的方法中，可擴(kuò)增出544bp的特異性片段。本發(fā)明專利技術(shù)提高了分子檢測靈敏度并且快速準(zhǔn)確，在豌豆孢囊線蟲檢測以及豌豆孢囊線蟲病的早期診斷方面，具有很高的應(yīng)用價值。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬生物
，涉及豌豆孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記全序列、特異性SCAR標(biāo)記引物序列及豌豆孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速分子檢測方法。
技術(shù)介紹
豌豆孢囊線蟲(H. goettingiana Liebscher, 1892),是歐洲一些國家中侵染豌豆的主要病害。目前已在歐洲、非洲、前蘇聯(lián)和地中海地區(qū)有分布，美國也有報道，但是相關(guān)分布范圍較小。豌豆孢囊線蟲在我國的分布和傳播正在調(diào)查中，目前在青海，湖北，四川等地均有為害大豆的發(fā)現(xiàn)。豌豆孢囊線蟲的寄主主要為豆科的豌豆(PisumsativumL.),蠶 豆(Viciafaba)JHl5_M (Viciaspp.),大豆(Glycines max),小扁豆(Lens sculenta)等(Winslow R D.Provisional lists of host plants of some root eelworm(Heteroderaspp.). Annals of Applied Biology 1954，41:591-605),此外還可寄生野草寄主，寄主范圍相對較窄。通常進(jìn)行3-6年輪作就可降低豌豆孢囊線蟲種群水平不對寄主構(gòu)成危害，但必須嚴(yán)格控制野草寄主(Di Vito M, Greco N. The pea cyst nematode. In:Lamberti, F. &Taylor, C. E. (Eds). Cyst nematodes. New York & London, Plenum Press 1986,321-332)。被侵染的豌豆植株會矮化，葉片變黃，根部分支減少，不能開花或者花過早脫落，同受大豆孢囊線蟲侵染的大豆一樣，豌豆的根部發(fā)育不良。豌豆孢囊線蟲完成一代大約需要3-15周，時間隨著土壤溫度的改變而變化。含有卵的孢囊即使在無寄主的條件下也能存活12年。豌豆孢囊線蟲侵染后，豌豆開花期表現(xiàn)出矮縮黃萎，豌豆孢囊線蟲抑制豌豆根瘤的形成和固氮作用，從而使豌豆產(chǎn)量降低，同時還可導(dǎo)致植株對土壤中一些對根部為害的菌類敏感，從而造成線蟲與菌類的復(fù)合侵染。目前豌豆孢囊線蟲的鑒定大部分仍然依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，豌豆孢囊線蟲的孢囊與其近緣屬種的孢囊形態(tài)類似，形態(tài)學(xué)鑒定耗時、需要很熟練的技術(shù)作為基礎(chǔ)，并且需要專門從事分類的人員來完成，因此豌豆孢囊線蟲傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法不適用于大規(guī)模的樣品檢測且不能有效的調(diào)查豌豆孢囊線蟲的分布和擴(kuò)散。為了彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定的不足，快速、準(zhǔn)確的對農(nóng)作物孢囊線蟲進(jìn)行鑒定和檢測，分子檢測技術(shù)迅速發(fā)展。20世紀(jì)80年代后期發(fā)展成功的DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))，使得直接擴(kuò)增DNA成為可能，在PCR基礎(chǔ)上還產(chǎn)生了各種新的分子標(biāo)記技術(shù)，例如RFLP，RAPD, AFLP, Real-time PCR, SSR等。這些分子標(biāo)記和檢測技術(shù)都成功的應(yīng)用到植物寄生線蟲特別是農(nóng)作物孢囊線蟲的分類鑒定和檢測過程中。各種分子標(biāo)記檢測技術(shù)各有利弊，在這些分子標(biāo)記中，RAPD標(biāo)記(RandomAmplified Polymorphism DNA)的優(yōu)點在于所需DNA量極少，要求設(shè)備也相對簡單。在植物寄生線蟲的分子檢測中應(yīng)用也越來越廣泛。RAPD標(biāo)記由Wi 11 iams等和Welsh等兩個研究小組在1990年發(fā)現(xiàn)。隨著RAPD技術(shù)的應(yīng)用，RAPD的缺點也凸顯出來，由于RAI3D引物非常短，只有十個堿基，退火溫度也較低，如果PCR體系變化，或者儀器變化，重復(fù)性會變差，而且易產(chǎn)生非特異性的條帶。為了彌補(bǔ)這一不足，Paran和Michelmore于1993年提出可以將其轉(zhuǎn)為 SCAR (sequence characterized amplified region)標(biāo)記(Paran I, MichelmoreR W. Development of reliable PCR—based markers linked to downy mildew risistencegenes in lettuce. Theoretical and Applied Genetics 1993，85:985-993.)，并應(yīng)用到了快速分子檢測中。在抱囊線蟲的RAPD 檢測實例方面，Edward P. CaswelI-Chen 等(Edward P，Caswell-Chenj Valerie M，Williamson, FrancesF. Wu. Random amplified polymorphicDNA analysis of Heterodera cruciferae and H. schachtii populations. Journal ofNematology 1992，24(3) :343-351)運(yùn)用 RAPD 標(biāo)記區(qū)分了 H. cruciferae 和 H. schachtii，用10個不同的隨機(jī)引物擴(kuò)增燕麥孢囊線蟲的不同種群的DNA，產(chǎn)生了 78條清晰的譜帶。1995 年 Lopez-Braiia I 等(Lopez-Braiia I，Romero M D，Delibes A. Analysis ofHeterodera avenae populations by the random amplifiedpolymorphic DNAtechnique.Genome 1995，Vol. 39:1996)對禾谷孢囊線蟲群體做了 RAPD分析。1996年，Jianbo Li等 (Jianbo Li，Jamal Faghhihij John M. Ferris, et al. The use of RAPD amplified DNA asmarkers for virulence characteristics in soybean syst menatode. Fundamental AndApplied Nematology 1996，19 (2) : 143-150)用RAPD標(biāo)記技術(shù)研究了大豆抗性品種與大豆孢囊線蟲的致病型之間的關(guān)系。1997年，Blok V. C.等(Blok V C，Philips，Harrower BE. Comparison of British populations of potato cyst nematodes with populationsfrom continental Europe and south America using RAPDs. Genome 1997,40:286-293)通過RAPD技術(shù)研究馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲兩個群體的線蟲致病型之間的遺傳關(guān)系ORAH)標(biāo)記與SCAR標(biāo)記的聯(lián)合應(yīng)用后，在孢囊線蟲的分子檢測方面也取得了—定進(jìn)展，例如 Fullanodo，A. et. al (Fullaondo A，Barrena Ej Viribay M，BarrenaI,Salazar A，Ritter E.Identification of potato cyst nematode species Globoderarostochiensis and G. pallida by PCR using specific primer combinations.N本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
【技術(shù)特征摘要】
1.豌豆孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的豌豆孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段的保守序列設(shè)計的特異性引物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性引物為HgoFl和HgoRl，其序列為HgoFl :5’ -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’，HgoRl :5’ -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’。4.豌豆孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速分子檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中含有權(quán)利要求2或3所述的特異性引物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，所述的特異性引物為HgoFl和HgoRl，其序列為HgoFl :5’ -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’，HgoRl :5...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：彭德良，亓?xí)岳?/a>，彭煥，黃文坤，丁中，賀文婷，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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