一種觀賞魚用紅酵母微生態(tài)制劑的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種觀賞魚用紅酵母微生態(tài)制劑的制備方法，該方法包括從斑馬魚的腸道中部分離出紅酵母、通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增及序列分析對(duì)紅酵母進(jìn)行鑒定與對(duì)紅酵母微生態(tài)制劑進(jìn)行制備。該方法不僅工藝流程操作簡(jiǎn)便，成本低廉，而且本方法制備的觀賞魚的養(yǎng)殖用紅酵母微生態(tài)制劑可以起到有效預(yù)防觀賞魚和水產(chǎn)品的疾病，增強(qiáng)抗病力的作用，降低病死率，同時(shí)不會(huì)造成環(huán)境污染和抗生素藥物殘留的問(wèn)題。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種分離與制備微生態(tài)制劑的技術(shù)，尤其是。
技術(shù)介紹
魚類腸道正常菌群是腸道微生物的重要組成成分，是各種生命活動(dòng)影響因素之一，是在與宿主共同進(jìn)化過(guò)程中形成的，以及二者之間相互作用而成的微生態(tài)系，與魚類營(yíng)養(yǎng)、物質(zhì)消化吸收、免疫應(yīng)答、器官的發(fā)育及疾病感染有關(guān)。腸道菌群跟據(jù)其作用可分為固有菌群和非固有菌群，或者分為原籍菌群Autocht honous flora和外籍菌群Allochthonous flora,這種分類只是相對(duì)的。紅酵母Rhodotorula廣泛分布于海洋及淡水環(huán)境 中，其富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、多種B族維生素、消化酶及生長(zhǎng)因子，同時(shí)也能產(chǎn)生一些保健功能活性物質(zhì)。更為重要的是，紅酵母能合成生產(chǎn)以蝦青素為主的類胡蘿卜素，是相當(dāng)優(yōu)質(zhì)的微生物飼料。目前人們把海洋紅酵母Rhodotorula glutinis作為一種水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌來(lái)應(yīng)用。紅酵母屬中有許多種類寄附在魚、蝦和貝類的身體上，與其共生，一般不致病，是魚、蝦、貝的開口餌料。斑馬魚Danio rerio作為一種新型模式生物近年來(lái)在研究人類遺傳、免疫、及生理方面倍受關(guān)注。利用紅酵母作為觀賞魚和水產(chǎn)品的飼料添加劑，將在防病治病、提高觀賞魚和水產(chǎn)品養(yǎng)殖生產(chǎn)力方面發(fā)揮巨大的潛能，并有利于綠色環(huán)保型觀賞魚和水產(chǎn)品的生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了有效預(yù)防觀賞魚及水產(chǎn)品的疾病，減低水產(chǎn)品死亡率，本專利技術(shù)提供，該方法不僅工藝流程操作簡(jiǎn)便，成本低廉，而且本方法制備的觀賞魚的養(yǎng)殖用紅酵母微生態(tài)制劑可以起到有效預(yù)防觀賞魚和水產(chǎn)品的疾病，增強(qiáng)抗病力的作用，降低病死率，同時(shí)不會(huì)造成環(huán)境污染和抗生素藥物殘留的問(wèn)題。本專利技術(shù)解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是該觀賞魚用紅酵母微生態(tài)制劑的分離、鑒定與制備方法包括以下步驟 (1)紅酵母的分離 無(wú)菌操作對(duì)斑馬魚的體表用75%的酒精消毒，取其腸道中部，置于盛有IOmL的無(wú)菌生理鹽水的離心管中，剪碎混勻，取適量均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)基內(nèi)的溫度為恒溫25-28°C，培養(yǎng)3天；挑選典型菌落轉(zhuǎn)種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基上，反復(fù)傳代2 3次，篩選出目的酵母接種到斜面?zhèn)溆茫凰龅鸟R鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基的成分及制備方法為去皮馬鈴薯190-210g，葡萄糖18-20g及瓊脂13. 5-16. 5g，由去離子水定容至990-1010 mL，PH值為7_8，115-126°C條件下滅菌18-22min ； (2)紅酵母的鑒定 Φ生理生化實(shí)驗(yàn)酵母菌生化試劑鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物有限公司，酵母糖發(fā)酵和碳源同化的實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行，保持培養(yǎng)基內(nèi)為恒溫25-30°C，培養(yǎng)2 5天，觀察結(jié)果。Φ的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增及序列分析 提取酵母菌DNA后，選取26S rDNA Dl /D2區(qū)的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送由生工生物工程上海有限公司進(jìn)行測(cè)序，采用BLAST和Clustalxl. 83程序進(jìn)行26S rDNA序列比對(duì)分析，進(jìn)而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和置信度檢測(cè)。(3)紅酵母微生態(tài)制劑的制備方法 Φ菌株提取 取一株(I)中提取的紅酵母菌Rhodotorula glutinis，保藏號(hào)為MCCC2A00030，在PDA培養(yǎng)基上保持恒溫25-30°C培養(yǎng)3天，在發(fā)酵培養(yǎng)基中保持恒溫25-30°C、190-210 rpm搖床培養(yǎng)4-6天，該菌26 S rDNA的GenBank登陸號(hào)是HQ323251 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為去皮馬鈴薯 190-210g，葡萄糖 18-22g，蛋白胨 2. 5-3. 5g，KH2PO4 O. 9-1. Ig，MgSO4O. 4-0. 6g，由去離子水定容至990 -1010 mL, PH值為7-8，在115_126°C條件下滅菌18_22min ; 0菌株活化用牙簽從斜面刮取一塊菌種接種于PDA液體培養(yǎng)基試管中保持恒溫25-300C，培養(yǎng)3天，再將其接種于發(fā)酵培養(yǎng)基試管中保持恒溫25-30°C，培養(yǎng)3天，接種量為IO6 CFU/ml，反復(fù) 3 次； @菌株擴(kuò)培將步驟Θ的液體菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在恒溫25-30°C、200rpm搖床培養(yǎng)5天，接種量為IO6 CFU/ml ； B菌株收集濃縮在無(wú)菌條件下，將步驟 的搖瓶培養(yǎng)菌液用O. 22um微濾膜過(guò)濾濃縮成500億CFU/ml菌液，獲得的濃縮菌液為微生態(tài)制劑。其中，上述觀賞魚用紅酵母微生態(tài)制劑的應(yīng)用方法發(fā)酵完成后，采用65°C以下低溫烘干粉碎后加水外噴涂使用；對(duì)于即時(shí)使用的產(chǎn)品，不必進(jìn)行烘干處理，這樣可以更好地發(fā)揮紅酵母中營(yíng)養(yǎng)因子的生理活性，也可以減少因烘干而導(dǎo)致的部分有益微生物的損失；在觀賞魚養(yǎng)殖飼料中微生態(tài)制劑的添加量為IO8 109CFU/g。本專利技術(shù)的有益效果是，該方法不僅工藝流程操作簡(jiǎn)便，成本低廉，對(duì)設(shè)備要求低，而且本方法制備的觀賞魚的養(yǎng)殖用紅酵母微生態(tài)制劑可以起到有效預(yù)防觀賞魚和水產(chǎn)品的疾病，增強(qiáng)抗病力的作用，降低病死率，同時(shí)不會(huì)造成環(huán)境污染和抗生素藥物殘留的問(wèn)題；另外，豆柏中大分子蛋白質(zhì)分解為小分子的肽類，提高了蛋白質(zhì)的消化吸收率，并通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)一步平衡了氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；發(fā)酵飼料中補(bǔ)充了由于紅酵母菌代謝引入的蝦青素，提高了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步說(shuō)明。圖I是酵母菌的生理生化特征。注+為陽(yáng)性，-為陰性(位置變化)。具體實(shí)施例方式(I)酵母菌的分離 無(wú)菌操作對(duì)斑馬魚的體表用75%的酒精消毒，取其腸道中部，置于盛有IOmL的無(wú)菌生理鹽水的離心管中，剪碎混勻，取適量均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)基內(nèi)的溫度為恒溫25-28°C，培養(yǎng)3天；挑選典型菌落轉(zhuǎn)種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基上，反復(fù)傳代2 3次，篩選出目的酵母，在4°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。將篩選出的酵母菌在平板上四區(qū)劃線，在25-28°C恒溫條件下培養(yǎng)2 3天，觀察其菌落形態(tài)。該菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天后菌落呈粉紅色圓形、表面光滑、隆起、濕潤(rùn)、不透明、邊緣整齊；酵母細(xì)胞呈橢圓形且較大，大小為4. 0-5. 5X5. 0-7. 5 μ m，進(jìn)行出芽生殖，載玻片培養(yǎng)未見假菌絲。(2)紅酵母的鑒定 Φ生理生化實(shí)驗(yàn) 酵母菌生化試劑鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物有限公司，酵母糖發(fā)酵和碳源同化實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行，28°C培養(yǎng)2 5天，觀察生理生化特征結(jié)果。酵母菌生理生化特性鑒定指標(biāo)有碳源發(fā)酵測(cè)試、碳源同化和肌醇同化測(cè)試。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該株菌分別進(jìn)行了葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、海藻糖6種碳源的發(fā)酵測(cè)試。結(jié)果顯示，該菌株不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖及海藻糖；同化試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，見附圖I酵母菌的生理生化特征。查閱《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，判斷該菌株的形態(tài)學(xué)和各項(xiàng)生理生化檢測(cè)結(jié)果符合紅酵母Rhodotorula的特征,初步確定該菌株為紅酵母。Q的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增及序列分析 參照CATB法提取酵母菌DNA后，選取26S rDNA Dl /D2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物為通用引物正向 NL— I: 5 — GCATAT-CAATAAGCGGAGGAAAAG— 3，反向 NL — 4:5 —GGTCCGT-GTTTCAAGACGG — 3，由生工生物工程上海有限公本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種觀賞魚用紅酵母微生態(tài)制劑的制備方法，該制備方法包括紅酵母的分離、紅酵母的鑒定及紅酵母微生態(tài)制劑的制備；其特征是無(wú)菌操作對(duì)斑馬魚的體表用75%的酒精消毒，取其腸道中部，置于盛有IOmL的無(wú)菌生理鹽水的離心管中，剪碎混勻，取適量均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)基內(nèi)的溫度為恒溫25-28°C，培養(yǎng)3天；挑選典型菌落轉(zhuǎn)種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基上，反復(fù)傳代2 3次，篩選出目的酵母接種到斜面?zhèn)溆?；所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基的成分及制備方法為去皮馬鈴薯190-210g，葡萄糖18-20g及瓊脂13. 5-16. 5g，由去離子水定容至990-1010 mL, PH值為7-8，115-126°C條件下滅菌18_22min ;紅酵母的鑒定包括生理生化實(shí)驗(yàn)及26S rDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增及序列分析；紅酵母微生態(tài)制劑的制備方法包括菌株提取、菌株活化、菌株擴(kuò)培及菌株收集濃縮。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生理生化實(shí)驗(yàn)；其特征是酵母糖發(fā)酵和碳源同化的實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行，保持培養(yǎng)基內(nèi)為恒溫25-28°C，培養(yǎng)2 5天，觀察結(jié)果。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的26SrDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增及序列分析；其特征是提取酵母菌DNA后，選取26S rDNA Dl...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：呂愛軍，胡秀彩，王藝，胡宏曉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：